本标准规定了检测动物饲料中莫能茵素含量的高效液相色谱(HPLC)方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中莫能菌素含量的测定。本方法检测限为5mg/kg。 NY/T 725-2003 饲料中莫能菌素的测定高效液相色谱法 NY/T725-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

NY/T725—2003
本标准是在参阅了美国全国饲料协会（NFIA）推荐的通用分析方法及国内外大量文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的，采用了高效液相色谱（HPLC)-柱后衍生化法。本标推由中华人民共和国农业部和全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家兽药评价中心（中国农业大学动物医学院）。本标准主要起草人：呙于明、沈建忠、张素霞、袁建敏。1范围
饲料中莫能菌素的测定
高效液相色谱法
本标准规定了检测动物饲料中莫能菌素含量的高效液相色谱(HPLC)方法。NY/T 725--2003
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中莫能菌素含量的测定。本方法检测限为5mg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有修改单（不包括勘误内容）或修改版均不适合本标准，然雨，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样方法
3方法原理
用甲醇-水提取试样中的莫能菌素，以甲醇-冰乙酸-水作为流动相、香草醛为衍生剂，用高效液相色谱-柱后衍生化-紫外检测法分离测定。4试剂和溶液
除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级用水的规定。4.1试样提取液：［甲醇（色谱纯）十水」（90+10）。4.2香草醛衍生液：量取5ml.浓硫酸，缓慢加人到250mL甲醇中，置冰水浴中，缓缓加人20g香草醛，混匀，脱气后避光保存，临用现配。4.3莫能菌素标准液：bZxz.net
4.3.1莫能菌素标准贮备液：准确称取莫能菌素标准品（纯度≥90%)0.1000g，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容，其浓度为1000μg/mL的储备液，置4℃冰箱中保存。4.3.2莫能菌素标准工作液：分别准确吸取一定量的标准贮备液（4.4.1），置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，配制成浓度为2.0μg/ml，4.0μg/ml,6.0μg/ml.,8.0μg/mL,10.0μg/ml.12.0μg/ml.的标准工作液。
5仪器和设备
实验室常用仪器、设备。
5.1高效液相色谱仪：配柱后衍生化装置和紫外检测器。5.2 离心机。
5.3振荡器。
5.4玻璃具塞三角瓶（250mL）。5.5微量进样器。
5.6微孔滤膜（0.45μm）。
NY/T 725—2003
6试样制备
按GB/T14699.1规定，取有代表性的样品，四分法缩减取约200g，经粉碎，全部过1mm孔筛，混勾装人磨口瓶中备用。
7测定步骤
7.1试样提取
称取一定量的试样（10.0g配合饲料，或5.0g浓缩饲料，或1.0g添加剂预混合饲料），置于250mL玻璃具塞三角瓶中，加入40mL试样提取液（4.1），往复震荡30min。静止10min，过滤。再向试样中分别加入30ml.试样提取液（4.1)，重复提取两次。合并三次提取液，用试样提取液定容到100mL。取1.mL用0.45um微孔有机滤膜过滤作为试样溶液，供高效液相色谱分析。7.2HPLC 色谱条件
色谱柱：Cs柱，长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或相当者。a）
柱温：室温。
流动相：甲醇：冰乙酸：水（94：3：3）。流动相流速：0.7mL/min。
衍生液流速：0.7mL/min。
反应管：不锈钢长10m，内径0.2mm。反应温度：95℃。
检测波长：520nm。
进样体积：20uL。
7.3HPLC 测定
取适量试样溶液（7.1)和相应浓度的标准工作液（4.3.2），作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。
8结果计算与表述
8.1试样中莫能菌素的含量按式(1)计算：X=mi×n
式中：
X—试样中莫能菌素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；ml--HPI.C试样色谱峰对应的莫能菌素的质量，单位为微克（μg)；m—--试样质量，单位为克(g)；n
稀释倍数。
8.2测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后一位。允许误差
两个平行测定的相对偏差不大于10%。2
（1）
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