本标准规定了非洲马瘟的临床诊断、病原鉴定和血清学试验技术的要求。本标准适用于马、骡和其他马科动物非洲马瘟的检疫。 GB/T 21675-2008 非洲马瘟诊断技术 GB/T21675-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 21675—2008
非洲马瘟诊断技术
Diagnostic techniques for African horse sickness2008-04-09 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-06-01实施
本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国动物尘与流行病学中心。本标准十要起草人：包静月、王淑娟、吴三、王志亮、宋翠平、封启民。GB/T21675—2008
GB/T21675--2008
非洲马瘟（Africanhorse sickness，AHS)是马科动物的一种非接触性传染的病毒性传染病。由呼肠孤病毒科环状病毒属的非洲码瘟病毒（AHSV)引起，以呼吸系统和循环系统变化为特征，常使马.骤致死，至少有两种库属节肢动物传播本病。该病有9个血清塑。《中华人民共和国动物防疫法》将本病列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。本标准诊断技术内容包括临床症状、病理变化、病原监定和血清学试验。本标准主要参考OIE哺乳动物、禽、蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准于册》（2000年版），并结合我国的弼究成果制定的。
非洲马瘟诊断技术
GB/T 21675--2008
本标难规定了非洲马瘟(AHS)的临床诊断病原鉴定和而清学试验技术的要求。本标准适用于马、疆和其他马科动物非马癌的检疫。2床症状
2.1最急性型或肺型
症状急性发作，潜伏期3d～5，特征为严重的渐进性呼吸道症状，初期仅显发热反应，最高体温可达10℃～41℃，持续1d～zd就降至常温，之后出现不间程度的呼吸困难，可见前腿分开，头前伸，鼻孔扩大。通常出汀较多，最后可见李性咳嗽，同时从鼻孔流出泡沫样黄色液体。以其自身的浆液性液体面溺死。这种病型康复率不到5%。2.2亚急性型或水肿型、心型
病初有发热反应(39℃～41℃)。潜伏期7d~14d。发热持续3d~6d，发热后期，出现特征性水肿。水肿肖先出现于颈部、呕上离和眼脸，以后可扩展至嘴唇、面颊、舌部、下额骨间、咽喉区，有时皮下水肿从额部至胸部不等，严重时胸部和肩部也出现水肿。晚期可见结膜和否殿侧、皮下出而点。最后变得烦不安，死于心力衰竭。一般在发热反应后4d~8·内死亡死亡率约50%。康复动物于3d~Bd内水肿逐渐滑失。
2.3急性或混合型
肺型和心型混合存在，临床不多见：潜伏期5.d-7a。病初肺部有轻微症状，然后头部和颈部出现明显水肿，最后死于心力衰竭。或先出现亚急性型症状，然后突发最急性型典型呼吸困难和其他临床表现。通常发热后3d~6d死亡死亡率超过80%。2.4最温和型
潜伏期5d~14d，后期表现驰张热（39℃~40℃），持续5d8d。可骼出现结膜轻度出血、脉博快、轻微厌食和精神抑郁。其他临床症状不明显。3病理学诊断
最特征及最常见的病变是皮下和航肉组织间胶样浸润，并以呕上窝和喉头尤为显著。宵底黏膜肿服一延伸到小肠前部。咽、气管、支气替充满黄色浆液和泡沫，肺泡，胸膜下和肺间质水肿，约有2/3病例有急性水肿。亚急性病例，头部，颈部和肩部水肿严重。.心内膜和心包膜有血点和出血痧斑、心肌变性。有些病例胸腔和心包积存火量黄白色-红色液体，淋巴结肿大、肝和胃出血。4实验室诊断
4.1病原分离和鉴定
4.1.1试剂
4.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS)见B.1.2)。4.1. 1.2含有青素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)(见 B.1.4)。4.1.1.350%甘油-磷酸盐缓冲液(见B.1.3)。4.1.1.4MEM(最低限度必需氨基酸营养液）完全营养液（见B.2.2)4.1.1.5MEM维持液(见B.2.3)。
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4.1.2样品采集
发热动物取抗凝血，死亡动物取2g~4g小块脾、肺和淋巴结，保存于4℃或放人50%甘油-磷酸盐缓冲液中，4℃运送和保存。用含有青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS)将组织快配成10%悬液后，供分离。
4. 1.3病毒分离
非洲马瘟病毒（AHSV)可首接以仓鼠将细胞（BHK-21）、猴稳定细胞（MS)和绿瘀肾细胞（VERO)细胞系进行分离。肝素抗凝血液样品勿需稀释就可使用，将样品接种上述细胞，吸附60nin后，加人MEM维持液。若用脾、肺等组织病料，则需膦碎以含毒缤素链霉素的磷酸盐缓冲液（PIS)或MEM完会营养液制成10%的组织悬浮液。接种后12d~18d可出现塑聊病变效应（CPE），如言传一代仍无CPE，则判为阴性。
4.1.4乳鼠分离
AHSV 可用 2 窝 1 Ⅱ龄
出现补经症状。取发病鼠胰
感染牵为100%。
乳鼠通过脑内按种进行分离，阳性病料接种3d～15d后，乳鼠可,再脑内接种6只以上乳鼠。第一次代的潜然期应缩短为2d一5d,4.1.5反转录-聚合醇链反
以 RT-PCR法撑领AASV的
4.1.5.1器材
PCR扩增仪，磷体利研科，无降
4, 1. 5.2试辨
4. 1.5.2.1引物！物 S7P1
(5'GTA AGT GIMTC GCT A
4. 1. 5. 2. 2
75%着靓第B.4章
4. 1. 5. 2. 3
4. 1. 5. 2. 4
二乙基焦磷酰胺（DEP
一步法PCR试剂信
4. 1. 5.2.5
4. 1.5.2. 6 1%的现癌耗胶(见第4. 1. 5.2. 70. 5×T酸-1
4. 1.5.2.8 2倍反应凝鲁
4.1.5.2.9反转录酶稀
上唯酶混鲁场，
的1.5mL离
GGA TG'),双向引物 S7P2
承的水
见第B葛章)
去上清其他鼠氯甲烷(分析纯)、异丙醇(分析纯）4. 1. 5. 2. 10
4.1.5.3操作方法
在70℃预冷的腹磷铢甲拥人1mLTrizol。4. 1.5. 3. 13
取 100 mg病料，用火藤的剪刀剪释。“用炎菌的锻子夹裂加有 Trizol 的研体中，充分研磨。4. 1. 5. 3. 2
将研磨好的组织匀录转移到的离心管中，离心12e01/min，10min，4℃。4. 1. 5. 3. 3
4. 1.5. 3. 4
取清，静置5min。加人200μL三氯烧，振荡混匀155，静置2min～3min。离心12 000 r/min,15 min,4℃
4.1.5.3.5取上消到新的离心管中，加等体积的异醇，混匀，静置10muin。离心120001/min，1d min,4C.
4.1.5.3.6去上消，加人1ml75%乙醇，离心12000r/min，5min，1C。4.1.5.3.7按步骤1.1.5.3.6重复离心-次。4.1.5.3.8去上清，室溢十爆RNA5min4.1.5.3.9加人100 μLDEPC处理过的水溶解RNA。4.1.5.3.10每管RT-PCR扩增混合液体系的总体积为25μL，其中含有12.5ul.2倍反应混合液、1μL正向引物S7P1(10μol/L)1反向物S7P2(10μmol/L),1μL反转录酶和Tu混合物、2
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3L从被检样品中提取的RNA和6.5LDEPC处理过的水。每份被检样品检测2次。每次检测设置标准阳性对照和标准阴性对照。标准阳性对照用阳性对照RNA作为模板，而标准阴性对照用DEPC处理过的水作为模板。
4.1.5.3.11置于PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增反应。RT-PCR扩增反应的条件如下：50℃，30min进行反转录；94℃，2min进行Tay酶的激活；40个循环的PCR（94℃，1min,55℃，1.5min，72℃,2.5min);72℃,7min延佛。4.1.5.3.12扩增反应后，用1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，观察扩增片断大小。4.1.5.3.13结果判定：如果阳性对照出现1179bp大小的特异的扩增条带，阴性对照无任何扩增条带，说明检测结果成立。当该检测样品出现1179bp大小的特昇的扩增条带，检测结果为RT-PCR检测阳性。
4.1.5.3.14序列测定和分析。RT-PCR检测阳性的扩增产物交付有关公司进行序列测定，序列测定的结果进行序列分析，如在GenBank(网证：http：//Ⅱcbi.nln.nih.gov/blast/)中进行最相似序列瘦寻（BLAST)，如果样品序列为特异的非洲马瘟病毒VP7基因序列，则说明受捡样品检测结果为非洲马癌病毒病原核酸阳性。
4.2血清学试验
4.2.1间接酶联免疫吸附试验（IELISA)以重组VP7蛋白为抗原，检测AHSV抗体4.2.1.1器材
ELISA反应板，酶联免疫吸附检测仪，加样器等：4.2.1.2试剂
4.2. 1.2. 1重组 AHSV抗原。
4.2.1.2.2包被液：0.05mol/1.pH9.6碳酸盐缓冲液（见第B.11章）。4.2.1.2.3洗涤液：含0.05%吐温-20的pH7.4的PBS见第B,13章）4.2.1.2.4封闭液及抗体蒂释液：含3%牛血清白蛋白(BSA)的pH7.4的PBS(见第B:14章)。4.2.1.2.5辣根过氧化物酶-抗马球蛋白结合物。4,2. 1.2. 6底物:A液、B液(见第B.15章)。终止液：1mol/LH，SO,（见第B.16章)或10%洗洁精（见第B.17章）。4, 2. 1. 2, 7
4.2.1.3操作方法
4.2. 1. 3.1抗原包被:将重组 AIISV-4VP7 以 0. 05 mal/L PH9. 6碳酸盐缓冲液(包被液)稀释,包被酶标板，4℃孵育过夜。
4.2.1.3.2洗板：以0.05%吐温-20溶液（洗涨液)洗酶标板5次，将酶标板在吸附材料上轻拍，除去剩余冲洗。
4.2.1.3.3封闭：以含3%BSA的pH7.4PHS封闭酶标板，200μL/孔，于37℃放置1h。4.2.1.3.4弃去封闭液，将酶标板在吸附材料上轻拍。4.2.1.3.5加待检血清和对照血清，将待检血消、阳性和阴性对照血清，以含3%BSA的pH7.4的PBS(抗体稀释液》按1：40稀释，每孔加入100μL，37℃培养1h。如测量抗体效价，将待检血清自1：40稀释开始，进行2倍连续帮释后，加人酶标板（100μL/孔），每排孔加一份血清，阳性和阴性对照做法相同。37℃放置 1 h
4.2.1.3.6按步骤4.2.1.4.2冲洗酶标板。4.2.1.3.7加酶标结合物：将爆根过氧化物-抗马球蛋白结合物以含3%BSAPH7.4的PBS(抗体稀释腋）稀释，加人孔（100.uL/孔）37℃放置1h，4.2.1.3.8按步骤4.2.1.4.2洗酶标板。4.2.1.3.9加底物溶液：按100μL/孔加入新配制的底物溶液。GB/T 21675-2008
4.2.1.3.10终止反应，约5min~10min后，加入1001mol/LHSO或10%洗洁精终止显色反应(朗性对照开始显色之前)。
4.2.1.3.11读数及结果判定：如果用1mol/LHS0,终止，上450nm判读结果：如果用10%洗洁精终止，于620nm判读结果，临界值的计算为阴性对照吸收值加0.6(0.6为用-组30份阴性血清获得的标准差），如待检血清的光吸收值低于临界值判为阴性，如高于临界值十0.15判为阳性，如吸收值介于怖界值和临界值十0.15之叫则判为可疑，需采用另一种方法以证实这一结果。4. 2.2微最补体结合反应(MCF)
微单补体结合反应（MCF)检测AHSV抗体4.2.2.1材料
4.2.2.1.1含1%明胶的巴比要媛冲盐液（见第章4.2.2.1.2血清样品，无红细瘾，4.2.2.1.3抗原是AHS
备方法见附录A)。在缺差
用 4 个~8 个单位。
4. 2. 2. 1. 4 补体(C)
4. 2. 2. 1. 5
溶而索
4. 2. 2. 1. 6
4. 2. 2. 1. 7
溶血手
面成，SRBCs被标
4. 2. 2. 1. 8
对照血消。
对照鼠
4.2. 2. 1. 9\U\
机，光电比色计。
必须加热灭活：马血清56℃，斑盛典清60驴血清62℃，灭活30mim。解的蔗糖丙葡提取物，对照抗原是窥同样法提取的未感染鼠脑（制标准血清时，抗原应用本地制备的阳性对想血清进行滴定，在试验中，使的豚鼠
竿红细
菌静脉采
（HS)是将
%浓度。
日性对照血
鲁6在量满
4.2.2.2操作方滤
4. 2. 2. 2. 1
血猜、粉
体摄抗原在
血清和补
血清和 SRB
分别加有4C
CF抗原和 SRB
对照抗原利SRBC
学在阿
释成含2个溶
补体血单位）2C
4CHsu、2CH稀释的补体
用其来致敏洗遗的SRBCs制备
康的抗体明非马的血清用作阴性转头可插界微滴定板的离心
反应18h星设以下对照：
1CH：补CF抚原和照抗原；
4.2.2.2.2在微量板各孔中加人效敏的SRBCs(3%）4.2.2.2.3试验板置于37℃放置30min.4.2.2.2.4将微壁板以1000r/min离心5min。4.2.2.2.5记录所有孢的溶血情况。以50%溶血作为终点读取结果。4.2.2.2.6结果判定
试验成立的条件：
当空白对照孔g)完全不溶血(卡十十+）；补体对照孔f)完全辫血（一）：其他各项组合对照孔a).b).c).d)，e)完全溶血（一），说明试验结果成立；与CF抗特异性结合补体的血清最高稀释度的倒数即为其效价。效价1/10或更高为阻性，低于 1/10 为阴性。
附录A
（规范性附录）
非洲马瘟MCF抗源的制备方法
抗原制备采用蔗糖-丙酮抗原，其方法是：GB/T 21675---2008
将感染鼠脑加人4倍量8.5%蔗糖（冷)溶液，置玻璃研磨器中充分研磨后：徐徐滴加到20倍(冷）内酮内，近加边搅拌，静置15min后，弃素起清两酮下粉红色胶状沉淀物，再加入20倍（冷）丙酮，充分搅拌，冰浴1h以上,去上清(原酮),将沉淀物置于下燥器两用真空泵抽干呈均句粉末，如入相当于匀浆总量的 0. 4 倍的巴比要缓冲液(1335尼附录),置 4 ℃稿中过夜,置玻璃研磨器中充分研廉后，3000r/min～350%
用作抗原对照的健康
min心1h，上清液，置4球箱保存用。MB亦同样按龙糖-芮酮处现。
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B.1磷酸盐缓冲液(PBS)
B. 1. 10. 1 mol/L PBS
飘化钠（NaCl）
氯化钾(KCI)
磷酸二氢钾(KH,PO.)
磷酸氢二钠(Na,HPO.）
双蒸馏水(ddHz)
附录B
(规范性附录）
试剂的配制
1 000 ml.
103kPa高压蒸汽灭菌30min。室温或1℃冰箱保存。B.1.20.04mol/LPBS(pH7.2~7.4)0. 1 rmol/L FPBS
双蒸馏水(ddH,)
103kPa高压蒸汽灭菌30min。室温或4C泳箱保存，B.1.350%甘油-磷酸盐缓冲液(PIS,PH7.4)400mL
0.04mo1/LPBS与纯甘油（分析纯）等最混和，调整pH率7.4分装为小瓶，经103kPa高压蒸汽灭菌 30 min,室温或 4℃冰箱保存。B. 1. 4加青霉素链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.2~7.4)加人终浓度100IU/mL.青舞素和100μg/mL链露素的0.04mol/LPBS(pII7.2~7.4)。D.2MEM完全营养液和维持液
B.2.1MEM(最底限度必需氨基酸营养液)基础营养液MEM干粉
碳酸氢钠
燕馅水(dO)
游解后过滤除菌，4℃保存。
B.2.2MEM完全营养液（pH7.2)
加至1000mL
MEM基础营养液中加下列成分使达到最终浓度：10%火活特牛血清；
100TUJ/mL青素及100μg/mL链露素：2 mmol谷氨酰氨，
B.2.3MEM维持液(pH7.2)
MEM基础营养液中加下列成分使达商最终浓度：10%灭活续牛血清；
100IU/mL背霉素及100μg/mL链霉素：2mmol谷氨酰氨。
B.320gmmol/LL-glntanmin（谷氨酰氨）溶液（母液）谷氨酰氮(L-glutamine）
双蒸馏水(da)
100 mL
B.475%乙醇
无水乙醇
DEPC处理过的水
B，5DEPC处理过的水
去离子水
加至 100 mL
充分混匀，將瓶蔬拧松后置于
放置过夜，高压灭菌。
B, 60. 5× Tris 碱-确酸-乙三髋四乙酸(EIA)(TBE>缓神液,B, 6. 1 5× Tris 碱~砸酸
Tris碱
0. 5 nol/L pH
B.6.2 0.5XTri
5×0. 5 mol/
蒸馏水
1%的琼腊
B.7.1配方
琼脂糖
0.5×TBE暖冲毅
漠化乙锭溶
B.7.2配法
二胺四
酸-乙
mg/mL)
称取0.6g璟糖
60℃时人 2. 5 μL
置于200
酉艺酸(EDTA)(TBE)缓冲液
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E缓冲,溶解，冷却牵60
完意锭济活
巴比妥缨冲液（）
B.8.1配方
氯化钠NaCl(分析纯）
氯化镁（MgCl·6H.0)（纯）
氟化钙CaClz（分析纯）
巴比妥（化学纯）
巴比要钠(化学纯）
无离子水
B.8.2配法
Daze g
2000 mL
将巴比要加人500mL无离于水内，加热溶解后再加人其他成分和适量无离子水溶解后，无离子水加至2000L，分装，103kPa高压灭菌20min，冷却后置冰箱内保存备用。临用时稀释5倍B.91%明胶巴比妥缓冲液
B. 9, 1配方
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3.9.2配法
500 ml
将明胶辫于30mL35CBBS中，然后将其余BBS加入，混勺备用B. 10阿氏滴
路。10.1配方
葡萄糖
氯化钠
柠檬酸钠
无离芋水
B.10.2配法
1200 mL
将试剂溶化后，过滤，分装成6瓶，用70kPa灭菌20min，置4℃冰箱保存备用B.11包被液——0.05mol/L.pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸钠
碳酸氢钠
去离子水
用0.22m膜过滤除菌，室温保存备用。B. 12 pH7.4 PBS
氟化钠
鐵化钾
磷酸氢钠(Na HPO,·12H,0)
磷酸二氢钾(KH,PO)
200 mml
加去离子水900mL，用盐酸调pH至7.41,然后定容至1000mL：B.13
洗涤液——含0.05%旺温-20的pH7.4的PBS吐温-20
pH7. 4 PRS
B.14封闭液及抗体稀释液一
牛血白蛋白(BSA)
pH7. 1 PBS
封闭液应现用现配。
B.15底物
B.15.1A液
磷酸氨二钠(NaHPO.）
柠檬酸
过氧化氢尿素
去离子水
1 000 mL
含 3 %BSA 的 pH7. 4 PBS
避光4℃～~8℃保存，尽量现用现配。B. 15,2B液
EDTA（乙一胺四乙酸）
TMB(33-二氨基联苯胺）
去离子水
用0.45μm滤膜过滤，避光4℃~8℃保存，尽量现用现配。B.15.3用法
使用时，将A、B液按1：1的比例混合：61mol/LI,So4
浓硫酸
去离子水
将浓硫酸缓缓加到蒸瘤水中，混勾。B.1710%洗洁精
洗清精
去离手水
混匀备用。
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