本标准规定了干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量（以柠檬酸计）的测定方法。本标准适用于干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定。 GB 22031-2010 干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定 GB22031-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB22031—2010
食品安全国家标准
干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定
National food safetystandardDetermination ofadded citrate content in cheese and processed cheeseproduct2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB22031—2010
本标准代替GB/T22031-2008《干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量的测定酶-比色法》本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T22031-2008。
1范围
食品安全国家标准
GB22031—2010
干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐的测定本标准规定了干酪及加工干酪制品中添加的柠檬酸盐含量（以柠檬酸计）的测定方法。本标准适用于干酪及加工干酪略制品中添加的柠檬酸盐含量的测定。2规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理
测定样品中总柠檬酸盐的含量，扣除原料带入样品中的柠檬酸盐的量（以0.04倍乳糖换算），即为样品中添加的柠檬酸盐含量。柠檬酸盐以柠檬酸计。4分析步骤
样品中的总柠檬酸盐的测定和含量计算按附录A的规定执行。样品中的乳糖的测定和含量计算按附录B的规定执行。5分析结果的表述
样品中添加的柠檬酸盐含量按（1）式计算：wawe-rwi..
式中：
w。样品中添加的柠檬酸盐含量，以柠檬酸计，以质量分数（%）表示：w—样品中总柠檬酸含量，单位为质量分数（%）；wi——样品中乳糖含量，单位为质量分数（%）：原料乳清粉或乳粉中柠檬酸含量与乳糖含量的比率（柠檬酸/乳糖）（r=0.04)。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后两位。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。（1）
A.1范围
附录A
（规范性附录）
干酪及加工干酪制品中柠檬酸盐含量的酶法测定本标准适用于酶法测定干酪及加工干酪制品中的柠檬酸盐含量。A.2原理
GB22031—2010
柠檬酸盐裂解酶（CL）将柠檬酸盐转化为草酰乙酸盐和乙酸盐，苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的存在下催化脱羧草酰乙酸盐以及脱羧产物丙酮酸盐，分别转化成L-苹果酸和L-乳酸。NADH在反应中被氧化成了NAD+。在340nm处测定样品溶液中NADH的吸光度差值，计算样品中柠檬酸盐的含量。A.3试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。A.3.1三氯乙酸溶液（200g/L）：称取20g三氯乙酸（CCl;COOH）溶于水中，混匀，并定容至100mL。A.3.2氢氧化钠溶液（200g/L）：称取20g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.3氢氧化钠溶液（40g/L）：称取4g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.4氢氧化钠溶液（4g/L）：称取0.4g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.5氯化锌溶液（0.8g/L）：称取0.8g氯化锌（ZnClz），用水溶解后转移至1000mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.6缓冲液（pH7.8）：称取7.13g双甘氨肽(H2NCH2CONHCH,CO2H)，溶解于70mL水中，转移至100mL容量瓶中。用氢氧化钠溶液（A.3.2）调节pH至7.8，加入10mL氯化锌溶液（A.3.5）并定容至100mL。充分混合。储存在0℃～4℃的冰箱中，此溶液可以保存四周。A.3.7碳酸氢钠溶液（4.0g/L）：称取4.0g碳酸氢钠（NaHCO，），用水溶解后转移至1000mL容量瓶中定容。充分混合。
A.3.8烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）溶液：称取50mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（C2H27N,O14P2Na2）和100mg碳酸氢钠（NaHCO3），溶解于10mL水中。A.3.9硫酸铵溶液（422g/L）：称取42.2g硫酸铵[(NH4)2SO4]，用水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容。充分混合。
A.3.10苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）悬浊液：用硫酸铵溶液（A.3.9）分别溶解苹果酸脱氢酶（猪心，EC1.1.1.37）和乳酸脱氢酶（免肉，EC1.1.1.27），使苹果酸脱氢酶（MDH）的活性不低于600IU/mL和乳酸脱氢酶的活性不低于1400IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后，储存在0℃～4℃冰箱中，此溶液可以保存一年。
A.3.11柠檬酸盐裂解酶（CL）溶液：用0℃水溶解柠檬酸盐裂解酶（产气肠杆菌，EC4.1.3.6），使柠檬酸盐裂解酶的活性不低于40IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后，储存在0℃～4℃冰箱中，此溶液可以保存一周；在-20℃冰箱中，可以保存四周。A.3.12柠檬酸标准溶液（160μg/mL）：称取175mg一水柠檬酸（CeH:OH20），用水溶解后转移至1000mL容量瓶中，定容。充分混合。2
A.4仪器和设备
天平：感量为0.1mg。
A.4.2pH计：精度为0.1。
A.4.3粉碎机。
A.4.4具塞刻度比色管：10mL，分度值0.1mL。A.4.5中速滤纸。
A.4.6紫外可见分光光度计：340nm，1cm比色皿。A.4.7水浴锅。
A.5试样制备
A.5.1干酪
GB22031—2010
除去干酪的外壳或发霉的表层，使试样具代表性。用粉碎机（A.4.3）将试样粉碎，混匀。A.5.2干酪制品
选择具有代表性的试样，用粉碎机（A.4.3）粉碎，混匀。A.6分析步骤
A.6.1试液制备
称取1g（精确至0.0001g）试样（A.5），溶于50mL的温水（40℃～50℃）中，全部转移入100mL容量瓶中，冷却至20℃。再加入10mL三氯乙酸溶液（A.3.1），用水定容，混合均匀后静置30min。用滤纸（A.4.5）过滤，弃去初滤液约10mL。吸取25mL滤液于烧杯中，用氢氧化钠溶液（A.3.3）调节滤液pH至4后，再用氢氧化钠溶液（A.3.4）调节pH至8。将烧杯中的溶液转移入100mL容量瓶中，用水定容。同时做空白试验。
A.6.2测定
A.6.2.1标准曲线的绘制
试剂在使用前恢复至室温。准确吸取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL相当于0、80、160、200、320μg柠檬酸）两组柠檬酸标准溶液（A.3.12），分别置于10mL比色管（A.4.4）中，各加入1.00mL缓冲液（A.3.6）、0.10mLNADH溶液（A.3.8）、0.02mL苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）悬浊液（A.3.10），摇匀。在20℃～25℃水浴锅（A.4.7）中保持5min，用水定容至5.00mL。其中一组用1cm比色皿（A.4.6），以空气作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度Ag。另一组各加入0.02mL的柠檬酸盐裂解酶（A.3.11），混勾，在20℃～25℃水浴锅（A.4.7）中保持10min，用1cm比色血（A.4.6），以空气作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度A10。根据（2）式计算吸光度A，以柠檬酸含量为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。A-A0-A10
式中：
柠檬酸盐裂解酶添加前的吸光度；Ao
柠檬酸盐裂解酶添加后水浴10min的吸光度。Ai0
注：如果吸光度降低超过0.800，用水溶液稀释样品和空白测试，重复A.6.2.1步骤。A.6.2.2试液吸光度的测定
（2）
用移液管吸取两份2.00mL试液（A.6.1)，置于10mL比色管(A.4.4)中。以下步骤同A.6.2.1中“各加入1.00mL缓冲液（A.3.6）.绘制标准曲线”操作，在标准曲线上查出对应的柠檬酸含量。同时做空白试验。
A.7分析结果的表述
样品中柠檬酸的含量按式（A.2）计算。X
式中：
10000xmxV,xV
样品中柠檬酸的含量，单位为克每百克（g/100g）：标准曲线上查出的试液中柠檬酸的含量，单位为微克（μg)：试样的质量，单位为克（g)；
Vi—试样经脱蛋白处理后的定容体积，单位为毫升（mL)；V
吸取滤液体积，单位为毫升（mL)；滤液定容体积，单位为毫升（mL）；吸取试液体积，单位为毫升（mL）。GB22031—2010
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字A.8
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。B.1范围
附录B
（规范性附录）
干酪及加工干酪中乳糖含量的酶法测定本标准适用于酶法测定干酪及加工干酪制品中的乳糖含量。B.2原理
GB22031—2010
在β-半乳糖苷酶（β-GLS）催化下，乳糖被酶解为D-葡萄糖（G）和D-半乳糖（GL）。已糖激酶（HK）将D-葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖（G6P），同时将三磷酸腺苷（ATP）转化为二磷酸腺苷（ADP）受6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）催化，6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸（GA6P），同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）被还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。Ci2H2Ou（L）+H20B-GLS→D-CeHi2O（G)+D-CeHi2O6（GL)D-CHi20。（G)+ATPHK→G6P+ADPG6P+NADP++H2OG6PDH→GA6P+NADPH+HB.3试剂和材料
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。B.3.1乳糖标准物质（C12H22O11·H20），纯度≥99%。B.3.2亚铁氰化钾溶液(36g/L)：称取3.6g亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6]3H2O)，用水溶解，定容至100mL混匀。
B.3.3硫酸锌溶液（72g/L)：称取7.2g硫酸锌（ZnSO47H2O），用水溶解，定容至100mL，混匀。B.3.4硫酸溶液（2mol/L)：量取60mL硫酸，缓缓注入适量水中，冷却至室温后用水稀释至1000L，混匀。
警告：稀释浓硫酸时应当将硫酸缓慢加入水中，且不断搅动。否则会引起爆炸。B.3.5氢氧化钠溶液（200g/L）：称取20.0g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解，定容至100mL，混匀。B.3.6氢氧化钠溶液（4g/L)：称取4.0g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解，定容至1000mL，混匀。B.3.7硫酸铵溶液(422g/L)：称取42.2g硫酸铵[(NH4)2SO4]，用水溶解，定容至100mL，混匀。B.3.8柠檬酸盐缓冲液（pH6.6）：分别称取2.8g柠檬酸钠（CHsONas-2HO），0.042g柠檬酸（C6H：OH2O）和0.635g七水硫酸镁（MgSO47H2O）溶于40mL水中，用硫酸溶液（B.3.4）或者氢氧化钠溶液（B.3.6）调节pH至6.6±0.1后，用水定容至50mL，混匀后放置0℃～4℃冰箱中贮藏，可保存三个月，使用前放置至室温。
B.3.9三乙醇胺（TEA）缓冲液（pH7.6)：分别称取14.0g盐酸三乙醇胺（C6HisNO3HC1)，0.25g七水硫酸镁（MgSO47H,O），用80mL水溶解，用氢氧化钠溶液（B.3.5）调节pH至7.6±0.1后，定容至100mL，混匀后放置0℃～4℃冰箱中贮藏，可保持两个月。B.3.10NADP+一ATP一TEA缓冲悬浊液：分别准确称取65mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠（C2H26N,O17PNa2）和170mg5-三磷酸腺苷二钠盐（C1oH4NsO13PNa2），溶于30mL的三乙醇胺缓冲液（B.3.9）中，混匀后放置0℃～4℃冰箱中贮藏可保持两周，使用前放置至室温。5
GB220312010
B.3.11β-半乳糖苷酶-硫酸铵[B-GLS-(NH4)2SO4I悬浊液（pH约为7.6)：将B-半乳糖苷酶（β-GLS，埃希氏大肠杆菌，EC3.2.1.23）溶于硫酸铵溶液（B.3.7）中，使B-半乳糖首酶的活性不低于60IU/mL。缓慢搅匀成悬浊液后放置0℃～4℃冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。B.3.12已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶一硫酸铵[HK-G6PDH-(NH4)2SO4]悬浊液：将已糖激酶（HK，酵母，EC2.7.1.1)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH，酵母，EC1.1.1.49）溶于硫酸铵溶液（B.3.7）中，使已糖激酶活性不低于280IU/mL（25℃C），6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性不低于140IU/mL（25℃）。缓慢搅匀成悬冲液后放置0℃～4C冰箱中，可保存12个月。使用时该悬浊液的容器应浸入冰水中。B.3.13乳糖标准溶液（80μg/mL）：精确称取经87℃烘烤2h至恒重的乳糖标准物质（B.3.1）0.842g溶于水中，定容至100mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述溶液，用水稀释到100mL，即得浓度为80μg/mL乳糖标准工作溶液。该溶液放置0℃～4℃冰箱中，临用前配制。B.4仪器和设备
B.4.1天平：感量为0.1mg。
B.4.2定量滤纸：中速，直径15cmB.4.3比色管：10mL，带盖。
B.4.4分光光度计：340nm，1cm比色皿。B.4.5水浴锅：能在20℃36℃保温。B.5分析步骤
B.5.1试样制备
取有代表性的样品至少200g，充分混匀，置于密闭的玻璃容器内。B.5.2试液的制备
准确称取1g样品于烧杯。用温水（40℃～50℃）溶解，玻璃棒搅拌，将烧杯中样品完全转移至100mL容量瓶，用水定容，混匀。加入5mL亚铁氰化钾溶液（B.3.2），5mL硫酸锌溶液（B.3.3）和10mLNaOH溶液（B.3.6），每次添加后充分混合溶液，用水定容至100mL，混合均匀后静置30min。过滤，弃去开始的部分滤液。吸取5.00mL滤液于100mL容量瓶中，用水定容至100mL，即为试液。B.5.3标准曲线的绘制
用微量移液管吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL（相当于0，16，3248,64,80μg乳糖）乳糖标准溶液（B.3.13），分别置于比色管（B.4.3）中，各加入0.20mL柠檬酸盐缓冲溶液（B.3.8）、0.05mLβ-半乳糖苷酶-硫酸铵悬浊液(B.3.11)，摇匀，于水浴锅（B.4.5）中恒温15min。取出后加入1.00mLNADP一ATP一TEA缓冲溶液（B.3.10），0.05mL已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶一硫酸铵悬浊液（B.3.12），摇勾，于水浴锅（B.4.5）中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿（B.4.4），以乳糖标准溶液含量为零的试剂溶液作参比，在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。B.5.4试液吸光度的测定
准确吸取1.00mL试液（B.5.2）于比色管（B.4.3）中，加入0.20mL柠檬酸盐缓冲溶液（B.3.8），1.00mLNADP-ATP-TEA缓冲溶液（B.3.10），0.05mL已糖激酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶一硫酸铵悬浊液（B.3.12），摇匀，于水浴锅（B.4.5）中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min，作为试液参比溶液。准确吸取1.00mL试液（B.5.2）于比色管（B.4.3）中。以下按B.5.3“各加入0.20mL柠檬酸缓冲溶液（B.3.8）放置5min”操作，用1cm比色皿（B.4.4），在波长340nm处测定各比色管内溶液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量。B.6分析结果的表述
试样中乳糖的含量按式（4）计算cxVxV免费标准bzxz.net
X-10000×mxV×V4
式中：
-试样中乳糖的含量，单位为克每百克（g/100g）：标准曲线上查出的试液中乳糖的含量，单位为微克（μg)：-试料的质量，单位为克（g)；
Vi—试料经脱蛋白处理后的定容体积，单位为毫升（mL)；V2
吸取滤液体积，单位为毫升（mL）；滤液定容体积，单位为毫升（mL）；吸取试液体积，单位为毫升（mL）GB22031—2010
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字B.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7
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