GB/T 25879-2010
基本信息
标准号： GB/T 25879-2010
中文名称：鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 25879-2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法
GB/T25879-2010
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标准内容
ICS65.020.30
中华人民共和国国家标准
GB/T25879—2010
鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定
分光光度法
Determination of lysozyme in chicken egg white-Spectrophotometry
2011-01-10发布
资料专用章
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
数码防伪
2011-06-01实施
中华人民共和
国家标准
鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定
分光光度法
GB/T25879—2010
中国标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街18号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16
2011年2月第一版
印张0.5
字数8千字
2011年2月第一次印刷
书号：255066-1-41602定价
由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有
侵权必究
举报电话：（010)68533533
http：//foodmate.net本标准由中华人民共和国农业部提出言
本标准由全国备牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：场州大学动物科学与技术学院。本标准主要起草人：王金玉、谢恺舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林。http：//foodmate.netGB/T25879—2010
全品伙伴网h
1范围
鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定
分光光度法
本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法。本标准适用于鸡蛋蛋清中家菌博含量和活力的测定2规范性引用文件
GB/T25879—2010
下列文件中的条款道是之标准的引用而成为本标准的条款。凡是洋日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘读的内春）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本GB/T6682
3术语和定义
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。新实验室用水规格和试验方法
仅适用于本标准。
下列术语利
蛋清cgge
位于鸡蛋蛋匹内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质，3.2
lyozyue
溶菌酶
于改生物细胞壁的糖苷水解酶。种专门作
4鸡蛋蛋清中溶菌酷含量的测定
溶菌酶在281nm波k生有最大吸收峰。溶菌酶标准品用每升溶轰含9氯化钠的溶液溶解并稀释成不同梯度浓度，在2波长处测定吸光度并绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程。试样经过处理，按溶菌酶标准品测定方法测定试样中的吸光度，根据其吸光度值出标准曲线回归方程计算试样中济菌酶含量。
4.2仪器
4.2.1紫外可见分光光度计（波长范围190mm900mm，波长确定性土0.3nm，波长重复精度土0.1am）。4.2.2电子分析天平（感量0.1mg.1mg）离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管）。4.2.3
4.3试剂与材料
4.3.1溶菌酶标准品，优级纯，活力在20000U/mg左右。4.3.2氯化钠，分析纯。
4.3.3蒸留水，按GB/T6682执行。4.3.4医用脱脂纱布，
4.4试剂配制
4.4.10.9%氯化钠溶液：称取氧化钠（4.3.2)0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100mLhttp://foodmate.netGB/T25879—2010
4.4.2溶菌酶标准工作液：称取溶菌酶标准品（4.3.1)0.500g，以0.9%氧化钠溶液（4.4.1)溶解定容至1000mL，得到500μg/mL的溶菌酶标准工作液，于4℃密封保存备用，1周内使用。4.5分析步骤
4.5.1标准曲线的绘制
分别吸取溶菌酶标准工作液（4.4.2)1mL，2mL，3mL.4mL5mL于25ml容量瓶中，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1)稀释至刻度，混勾。用10mm石英比色Ⅲ比色，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）为参比溶液，在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度，以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程。4.5.2试样测定
鸡蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL，用0.9%氯化钠溶液稀释定容至100mL，混勾，避免起泡沫，吸取5mL蛋清的氟化钠溶液，1310g离心5min，取上清液，按照绘制标准曲线的操作步骤（4.5.1），在波长281nm处测定试样溶液的吸光度。平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。4.6结果的计算与表述
根据试样溶液吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c。鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量按式（1)计算：
式中：
X鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；试样溶液中溶菌酶的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V-试样溶液定容的体积，单位为毫升（mL)：V—试样的体积，单位为毫升（mL)。4.7精密度、准确度、灵敏度
4.7.1精密度
.............
.....(1)
本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV≤3%，批间变异系数CV≤5%。4.7.2准确度
鸡蛋蛋清溶液中漆添加溶菌酶标准品浓度在20g/ml60μg/mL范围内，回收率≥95%。4.7.3灵敏度
本方法检测鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶含量的最低检测限为0.3ug/mL。5鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定
5.1原理
溶菌酶通过溶解G菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低。睡的活力表示为在特定条件下单位时间内转化底物的速度。本标准根据该原理，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力。5.2仪器
5.2.1紫外可见分光光度计（波长范围190nm900nm，波长确定性士0.3nm，波长重复精度士0.1nm）。5.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）。5.2.3摇床（控温范围α℃~100℃，转速振幅：0z/min300r/min）5.2.4pH计（精密度±0.01)。
5.2.5离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管），2
ht
5.2.6高压灭菌锅。
5.2.7超低温冰箱。
5.3试剂与材料
5.3.1氯化钠，分析纯
5.3.2甘油（丙三醇），分析纯。5.3.3磷酸氢二钠，分析纯
5.3.4磷酸二氢钠分析纯。
5.3.5牛肉膏，生化试剂。
5.3.6蛋白陈，生化试剂，
醛母提取物，生化试剂。
5.3.8琼脂，生化试剂。
5.3.9溶壁微球菌cMicrococcuslysodeikticusFleming)5,4试剂配制与培养基制备www.bzxz.net
GB/T25879—2010
5.4.10.9%氟化钠溶液：称取氯化钠0.9g，溶解于蒸水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30min。
5.4.223%甘油（丙三醇）溶液：称取廿油20.0g，溶解于蒸馅水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30mins
5.4.30.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（NazHPO，·12HzO)71.63g，用蒸馏水溶解定容至1000mL；称取磷酸二氢钠（NaH，PO.：2H，O)33.00g，蒸增水溶解并定容至1000mL。取NaHPO溶液18.5mL与NaHPO，溶液8I.5mL混合，混匀即可。5.4.4固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋自陈1.08、氟化钠0.5.g溶解手100mL水中，各组分溶解后，加人琼脂2.0g，持续搅拌至琼脂完全溶解.用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4，并用水定容至100mL，分装在试管里，每管液量为15mL~20mL，加棉花塞，121高压灭菌30min后.倒人培养中加盖，冷却至室温。
5.4.5液体LB培养基：蛋白陈1.0、酵母提取物0.5、氯化钢1.0g溶解于100mL水中，用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4.分装在试管里，121℃高压蒸汽灭菌30mm。5.5分析步骤
5.5.1菌液的制备
将溶壁微球菌（5.3.9）先接种于灭菌的固体培养基（5.4.42中活化和扩大培养，再接种于灭菌的液体1.B培养基（5.4.5）中，37C据床培养至菌体增殖，培养9h~10h.将培养液1310g离心10min，收集沉淀的菌体。该菌体加入3倍体积灭菌的0.9%氯化钠溶液（5.4.1）悬浮，1310g离心10min，收集沉淀的菌体，重复4次～5次。再用20%甘油溶液（5.4.2）将菌体制成黏稠状，置于一60℃保存，半年内使用。
使用前，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）溶解溶壁微球菌，调至OD455吸光度值范围在1.2~-1.4，2℃~8C放置。
5.5.2鸡蛋蛋清溶液的制备
鸡蛋蛋清用4层纱布过滤。取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）定容至100mL，1310g离心5min除去不溶物。
5.5.3试样测定
按4.5的方法，在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度，并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。鸡蛋蛋清溶液、菌液丁25水浴中保温·在450nm波长处测定酶活力，试样测定反应体系见表1。合品伙伴网h
GB/T25879-2010
加人物
鸡蛋蛋清溶液
磷酸盐缓冲液(p6.2)
表1试样测定反应体系
测定液/mL
空白液/mL
用空白液调零，加0.2mL鸡蛋蛋清溶液到10mm石英比色Ⅲ中，从加入1.0mL菌液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为A，A按每分钟OD值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，鸡蛋蛋清中溶菌酶的活力按式(2)计算：AE455
式中：
鸡蛋蛋清中溶菌酶活力，单位为单位每毫克（U/mg）；在两时间点测定的吸光度AA2之差；-0.2mL鸡蛋蛋清溶液中含有溶菌酶的质量，单位为毫克（mg）（2
0.2mL鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶的质量E与试样溶液中溶菌酶的浓度c之间的关系按式（3）计算：
5.6重复性
在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数CV≤10%，GB/T25879-2010
打印日期：2011年3月22日F007
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版权专有慢权必究
书号：1550661-41602
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鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定
分光光度法
本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法。本标准适用于鸡蛋蛋清中家菌博含量和活力的测定2规范性引用文件
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下列文件中的条款道是之标准的引用而成为本标准的条款。凡是洋日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘读的内春）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本GB/T6682
3术语和定义
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。新实验室用水规格和试验方法
仅适用于本标准。
下列术语利
蛋清cgge
位于鸡蛋蛋匹内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质，3.2
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溶菌酶
于改生物细胞壁的糖苷水解酶。种专门作
4鸡蛋蛋清中溶菌酷含量的测定
溶菌酶在281nm波k生有最大吸收峰。溶菌酶标准品用每升溶轰含9氯化钠的溶液溶解并稀释成不同梯度浓度，在2波长处测定吸光度并绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程。试样经过处理，按溶菌酶标准品测定方法测定试样中的吸光度，根据其吸光度值出标准曲线回归方程计算试样中济菌酶含量。
4.2仪器
4.2.1紫外可见分光光度计（波长范围190mm900mm，波长确定性土0.3nm，波长重复精度土0.1am）。4.2.2电子分析天平（感量0.1mg.1mg）离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管）。4.2.3
4.3试剂与材料
4.3.1溶菌酶标准品，优级纯，活力在20000U/mg左右。4.3.2氯化钠，分析纯。
4.3.3蒸留水，按GB/T6682执行。4.3.4医用脱脂纱布，
4.4试剂配制
4.4.10.9%氯化钠溶液：称取氧化钠（4.3.2)0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100mLhttp://foodmate.netGB/T25879—2010
4.4.2溶菌酶标准工作液：称取溶菌酶标准品（4.3.1)0.500g，以0.9%氧化钠溶液（4.4.1)溶解定容至1000mL，得到500μg/mL的溶菌酶标准工作液，于4℃密封保存备用，1周内使用。4.5分析步骤
4.5.1标准曲线的绘制
分别吸取溶菌酶标准工作液（4.4.2)1mL，2mL，3mL.4mL5mL于25ml容量瓶中，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1)稀释至刻度，混勾。用10mm石英比色Ⅲ比色，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）为参比溶液，在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度，以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程。4.5.2试样测定
鸡蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL，用0.9%氯化钠溶液稀释定容至100mL，混勾，避免起泡沫，吸取5mL蛋清的氟化钠溶液，1310g离心5min，取上清液，按照绘制标准曲线的操作步骤（4.5.1），在波长281nm处测定试样溶液的吸光度。平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。4.6结果的计算与表述
根据试样溶液吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c。鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量按式（1)计算：
式中：
X鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；试样溶液中溶菌酶的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V-试样溶液定容的体积，单位为毫升（mL)：V—试样的体积，单位为毫升（mL)。4.7精密度、准确度、灵敏度
4.7.1精密度
.............
.....(1)
本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV≤3%，批间变异系数CV≤5%。4.7.2准确度
鸡蛋蛋清溶液中漆添加溶菌酶标准品浓度在20g/ml60μg/mL范围内，回收率≥95%。4.7.3灵敏度
本方法检测鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶含量的最低检测限为0.3ug/mL。5鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定
5.1原理
溶菌酶通过溶解G菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低。睡的活力表示为在特定条件下单位时间内转化底物的速度。本标准根据该原理，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力。5.2仪器
5.2.1紫外可见分光光度计（波长范围190nm900nm，波长确定性士0.3nm，波长重复精度士0.1nm）。5.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）。5.2.3摇床（控温范围α℃~100℃，转速振幅：0z/min300r/min）5.2.4pH计（精密度±0.01)。
5.2.5离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管），2
ht
5.2.6高压灭菌锅。
5.2.7超低温冰箱。
5.3试剂与材料
5.3.1氯化钠，分析纯
5.3.2甘油（丙三醇），分析纯。5.3.3磷酸氢二钠，分析纯
5.3.4磷酸二氢钠分析纯。
5.3.5牛肉膏，生化试剂。
5.3.6蛋白陈，生化试剂，
醛母提取物，生化试剂。
5.3.8琼脂，生化试剂。
5.3.9溶壁微球菌cMicrococcuslysodeikticusFleming)5,4试剂配制与培养基制备www.bzxz.net
GB/T25879—2010
5.4.10.9%氟化钠溶液：称取氯化钠0.9g，溶解于蒸水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30min。
5.4.223%甘油（丙三醇）溶液：称取廿油20.0g，溶解于蒸馅水中，定容至100mL，121℃高压灭菌30mins
5.4.30.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（NazHPO，·12HzO)71.63g，用蒸馏水溶解定容至1000mL；称取磷酸二氢钠（NaH，PO.：2H，O)33.00g，蒸增水溶解并定容至1000mL。取NaHPO溶液18.5mL与NaHPO，溶液8I.5mL混合，混匀即可。5.4.4固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋自陈1.08、氟化钠0.5.g溶解手100mL水中，各组分溶解后，加人琼脂2.0g，持续搅拌至琼脂完全溶解.用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4，并用水定容至100mL，分装在试管里，每管液量为15mL~20mL，加棉花塞，121高压灭菌30min后.倒人培养中加盖，冷却至室温。
5.4.5液体LB培养基：蛋白陈1.0、酵母提取物0.5、氯化钢1.0g溶解于100mL水中，用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4.分装在试管里，121℃高压蒸汽灭菌30mm。5.5分析步骤
5.5.1菌液的制备
将溶壁微球菌（5.3.9）先接种于灭菌的固体培养基（5.4.42中活化和扩大培养，再接种于灭菌的液体1.B培养基（5.4.5）中，37C据床培养至菌体增殖，培养9h~10h.将培养液1310g离心10min，收集沉淀的菌体。该菌体加入3倍体积灭菌的0.9%氯化钠溶液（5.4.1）悬浮，1310g离心10min，收集沉淀的菌体，重复4次～5次。再用20%甘油溶液（5.4.2）将菌体制成黏稠状，置于一60℃保存，半年内使用。
使用前，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）溶解溶壁微球菌，调至OD455吸光度值范围在1.2~-1.4，2℃~8C放置。
5.5.2鸡蛋蛋清溶液的制备
鸡蛋蛋清用4层纱布过滤。取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）定容至100mL，1310g离心5min除去不溶物。
5.5.3试样测定
按4.5的方法，在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度，并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。鸡蛋蛋清溶液、菌液丁25水浴中保温·在450nm波长处测定酶活力，试样测定反应体系见表1。合品伙伴网h
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鸡蛋蛋清溶液
磷酸盐缓冲液(p6.2)
表1试样测定反应体系
测定液/mL
空白液/mL
用空白液调零，加0.2mL鸡蛋蛋清溶液到10mm石英比色Ⅲ中，从加入1.0mL菌液开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为A，A按每分钟OD值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，鸡蛋蛋清中溶菌酶的活力按式(2)计算：AE455
式中：
鸡蛋蛋清中溶菌酶活力，单位为单位每毫克（U/mg）；在两时间点测定的吸光度AA2之差；-0.2mL鸡蛋蛋清溶液中含有溶菌酶的质量，单位为毫克（mg）（2
0.2mL鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶的质量E与试样溶液中溶菌酶的浓度c之间的关系按式（3）计算：
5.6重复性
在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数CV≤10%，GB/T25879-2010
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