GB/T 26625-2011
基本信息
标准号： GB/T 26625-2011
中文名称：粮油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 粮油 检验 大豆 异黄酮 含量 测定 高效 色谱法
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 26625-2011 粮油检验 大豆异黄酮含量测定 高效液相色谱法
GB/T26625-2011
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标准内容
ICS67.060
中华人民共和国国家标准
GB/T26625—2011
粮油检验
大豆异黄酮含量测定
高效液相色谱法
Inspection of grain and oils-Determination of soybean isoflavone-High performance liquid chromatography2011-06-16发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-11-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。GB/T26625—2011
本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、九三粮油工业集团有限公司。本标准主要起草人：高勇、杨长志、李铁柱、张洪祥、邓立育、王乐、丁丽莎1范围
粮油检验大豆异黄酮含量测定
高效液相色谱法
GB/T26625—2011
本标准规定了高效液相色谱法测定大豆异黄酮（大豆武、黄豆黄素、染料木武、大豆黄素、黄豆黄素元、染料木素）含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示，精密度的要求。
本标准适用于大豆，豆奶粉、豆豉中大豆异黄酮含量的测定。本标准测试方法的最低检测限为2.5ng/kge2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取，提取液经离心，浓缩、定容、过滤，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。
4试剂与材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。4.1乙睛：色谱纯。
4.2甲醇。
4.3乙酸。
4.490%甲醇溶液：取900ml甲醇，加人100ml水，混勾。4.560%甲醇溶液：取600ml.甲醇，加人400ml.水，混匀。10%甲醇溶液：取100ml甲醇，加人900ml水，混勺。4.6
0.1%乙酸溶液：取1ml.乙酸，置于1000ml容量瓶中，用水定容至刻度。4.7
0.1%乙酸乙溶液：取1ml.乙酸，置于1000ml.容量瓶中，用乙睛溶解并定容至刻度。4.8
4.9大豆武（daidzin）：纯度不低于98%。染料木武（genistin）：纯度不低于99%4.10
4.11大豆黄素（daidzein）：纯度不低于98%。4.12染料木素（genistein）：纯度不低于98%。4.13黄豆黄素（glycitin）：纯度不低于98%。4.14黄豆黄素武元（glycitein）：纯度不低于98%4.15标准储备溶液配制：
4.15.1大豆异黄酮标准储备溶液：分别准确称取适量的大豆武、染料木武、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素武元标准品，分别用60%甲醇（4.5）配成浓度为1mg/ml.的标准储备溶液。一18℃避1
GB/T26625—201
光保存，有效期6个月。
4.15.2大豆异黄酮混合标准中间溶液：分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液（4.15.1）0.5mL于同一10mL容量瓶中，用60%甲醇（4.5）定容至刻度，配制成各组分浓度为50μg/mL的大豆异黄酮混合标准中间溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期3个月。4.15.3大豆异黄酮混合标准工作溶液：分别吸取50.0μL、100.0μL、200.0μL、300.0L、1000.0μL上述大豆异黄酮混合标准中间溶液（4.15.2）于10mL容量瓶中，用10%甲醇（4.6）溶液配成各组分浓度0.25μg/mL，0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL.5.00μg/mL系列的大豆异黄酮混合标准工作溶液，℃～4℃冷藏避光保存，有效期一周。4.16滤膜：0.45μm。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。5.2分析天平：感量0.01mg、感量0.01g。5.3旋转蒸发器。
5.4超声波清洗器：50W。
5.5离心机：10000r/min。
5.6粉碎机。
5.7组织捣碎机。
5.8浓缩瓶：250mL。
5.9样品筛：孔径2.0mm。
6试样制备与保存
6.1试样制备
6.1.1大豆
取有代表性样品约500g，用粉碎机（5.6）粉碎使其全部通过孔径2.0mm样品筛（5.9），混匀，装人洁净容器作为试样，密封备用。6.1.2豆豉
取有代表性样品约500g，用组织捣碎机（5.7)擒碎，混匀，装人洁净容器作为试样，密封备用。6.2试样保存
粉碎试样于4℃以下保存。试样制备过程中，应防止样品污染或组分变化。7操作步骤
7.1提取
称5g（精确到0.01g）试样于250mL具塞三角瓶中，加90mL90%甲醇溶液（4.4）.置于超声波清洗器（5.4）中60℃提取30min，在离心机（5.5）中10000r/min离心10min，上清液转移至250mL浓缩瓶（5.8）中，残渣再加人60mL90%甲醇溶液进行提取，上清液也转人250mL浓缩瓶，在旋转蒸发器（5.3）60℃浓缩至约40mL。浓缩液转人50mL容量瓶，用10%甲醇溶液（4.6）冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1mL提取液通过0.45μm滤膜（4.16），供高效液相色谱仪测定。7.2色谱参考条件
色谱参考条件如下：
a）色谱柱：RPCi：柱（250mm×4.6mm5μm）或性能相当的色谱柱；b）流动相：0.1%乙酸溶液（4.7）和0.1%乙酸乙睛溶液（4.8），按表1的规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；
d）柱温：40℃；
波长：260nm；
进样量：20μL。
时间/min
7.3测定
表1梯度洗脱表
0.1%乙酸水溶液/mL
GB/T26625—2011
0.1%乙酸乙腈溶液/mL
参考上述色谱条件（7.2）调节高效液相色谱仪，使大豆异黄酮各组分的色谱峰完全分离。分别吸取20μL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液（4.15.3）和样液（7.1)进行液相色谱测定，分别得到大豆异黄酮各组分的标准工作液峰面积（A.）和样液大豆异黄酮各组分峰面积（A.）。如果样液中大豆异黄酮某一组分峰面积与标准工作溶液中的该组分峰面积相差较大时，稀释样液或调整标准工作液浓度后再行测定。
在上述色谱条件下，大豆异黄酮各组分的保留时间约为：大豆武8.2min、黄豆黄素8.8min、染料木武11.0min、大豆黄素15.3min、黄豆黄素武元16.3min、染料木素19.4min。标准品的色谱图参见附录A。
7.4空白试验
除不加试样外，按7.1~7.3操作步骤进行测定。8结果计算与表示
8.1大豆异黄酮各组分含量
按式（1)计算试样中大豆异黄酮各组分含量（mg/kg）。X-AXC.xV
-试样中某一大豆异黄酮组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；X
A-一试样提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积；A，大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积；C.大豆异黄酮混合标准液中某一组分的淤度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V—试样提取液最终定容体积，单位为毫升（mL）：一试样质量，单位为克（g）。
注：计算结果应扣除空白值。
8.2大豆异黄酮总含量
试样大豆异黄酮总含量为各组分之和，按式(2)计算：X-EX.
GB/T26625—2011
式中：
X—试样中总大豆异黄酮含量，单位为毫克每千克（mg/kg）。注：本标准6种异黄已包括大豆中异黄酮的绝大部分组分，可认为是大豆异黄酮总含量8.3结果表示
取两次测定结果绝对差值小于重复性限的平均值为测定结果，单位为毫克每千克（mg/kg），保留三位有效数字。如果两个独立测试结果的绝对差值超过重复性限，应弃去该测试结果。再重新完成两个独立测试。
9精密度
9.1重复性
在重复性条件下，获得的两个独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限。各组分大豆异黄酮含量2.5mg/kg～30mg/kg范围内，其重复性限r计算方程参见附录B。9.2再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R。各组分大豆异黄酮含量2.5mg/kg~30mg/kg范围内，其再现性限R计算方程参见附录B。4
1-—大豆武；
黄豆黄素：
染料木：
大豆黄素：
黄豆黄素武元：
染料木素。
附录A
（资料性附录）
大豆异黄酮标准品液相色谱图
图A.1大豆异黄酮标准色谱图
GB/T26625—2011
GB/T26625—2011
附录B
（资料性附录）
精密度计算
本标准的精密度是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定的要求确定的，其重复性限?和再现性限R以95%的可信度来计算。
重复性限「和再现性限R计算方程组分名称
大豆武
黄豆黄素
染料木武
大豆黄素
黄豆黄素武元
染料木素
含量范围/（mg/kg）
重复性限
r=0.1357m+0.4000
r=0. 127 5m+0. 486 4
r=0. 097 3m+0.704 7
r=0.097 6m+0.806 6
r=0.186 0m+0.2568
r=0.1147m+0.4391
r=0. 124 1m+0. 481 0
r=0.0741m+0.738 9
r0. 122 3m+0. 544 8bZxz.net
= 0. 129 0m-f-0, 185 3
r=0. 098 2m+0. 664 3
0.1147m+0.579 5
注：m为该组分的含量，即该组分两个独立测定结果的算术平均值。再现性限R
R0.2239m0.2762
R-0.1685m+0.3600
R=0.2351m+0.3089
R-0.1841m+0.6578
R-0.1836m+0.4832
R-0.1369m+0.0391
R-0.1598m+0.5105
R-0.164 0m-0.136 8
R=0.161 3m+0.676 2
R-0.0718m+1.2041
R=0.137 0m+0.750 2
R=0.088 5m+0.854 4
参考文献
GB/T26625—2011
［1]GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义
［2]GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）重复性与再现性的基本方法
第2部分：确定标准测量方法
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中华人民共和国国家标准
GB/T26625—2011
粮油检验
大豆异黄酮含量测定
高效液相色谱法
Inspection of grain and oils-Determination of soybean isoflavone-High performance liquid chromatography2011-06-16发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-11-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。GB/T26625—2011
本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、九三粮油工业集团有限公司。本标准主要起草人：高勇、杨长志、李铁柱、张洪祥、邓立育、王乐、丁丽莎1范围
粮油检验大豆异黄酮含量测定
高效液相色谱法
GB/T26625—2011
本标准规定了高效液相色谱法测定大豆异黄酮（大豆武、黄豆黄素、染料木武、大豆黄素、黄豆黄素元、染料木素）含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、试剂制备与保存、操作步骤、结果计算与表示，精密度的要求。
本标准适用于大豆，豆奶粉、豆豉中大豆异黄酮含量的测定。本标准测试方法的最低检测限为2.5ng/kge2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
试样用甲醇-水溶液超声波振荡提取，提取液经离心，浓缩、定容、过滤，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。
4试剂与材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中一级水的规定。4.1乙睛：色谱纯。
4.2甲醇。
4.3乙酸。
4.490%甲醇溶液：取900ml甲醇，加人100ml水，混勾。4.560%甲醇溶液：取600ml.甲醇，加人400ml.水，混匀。10%甲醇溶液：取100ml甲醇，加人900ml水，混勺。4.6
0.1%乙酸溶液：取1ml.乙酸，置于1000ml容量瓶中，用水定容至刻度。4.7
0.1%乙酸乙溶液：取1ml.乙酸，置于1000ml.容量瓶中，用乙睛溶解并定容至刻度。4.8
4.9大豆武（daidzin）：纯度不低于98%。染料木武（genistin）：纯度不低于99%4.10
4.11大豆黄素（daidzein）：纯度不低于98%。4.12染料木素（genistein）：纯度不低于98%。4.13黄豆黄素（glycitin）：纯度不低于98%。4.14黄豆黄素武元（glycitein）：纯度不低于98%4.15标准储备溶液配制：
4.15.1大豆异黄酮标准储备溶液：分别准确称取适量的大豆武、染料木武、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素武元标准品，分别用60%甲醇（4.5）配成浓度为1mg/ml.的标准储备溶液。一18℃避1
GB/T26625—201
光保存，有效期6个月。
4.15.2大豆异黄酮混合标准中间溶液：分别移取上述各组分大豆异黄酮标准储备溶液（4.15.1）0.5mL于同一10mL容量瓶中，用60%甲醇（4.5）定容至刻度，配制成各组分浓度为50μg/mL的大豆异黄酮混合标准中间溶液，0℃～4℃冷藏避光保存，有效期3个月。4.15.3大豆异黄酮混合标准工作溶液：分别吸取50.0μL、100.0μL、200.0μL、300.0L、1000.0μL上述大豆异黄酮混合标准中间溶液（4.15.2）于10mL容量瓶中，用10%甲醇（4.6）溶液配成各组分浓度0.25μg/mL，0.50μg/mL、1.00μg/mL、1.50μg/mL.5.00μg/mL系列的大豆异黄酮混合标准工作溶液，℃～4℃冷藏避光保存，有效期一周。4.16滤膜：0.45μm。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。5.2分析天平：感量0.01mg、感量0.01g。5.3旋转蒸发器。
5.4超声波清洗器：50W。
5.5离心机：10000r/min。
5.6粉碎机。
5.7组织捣碎机。
5.8浓缩瓶：250mL。
5.9样品筛：孔径2.0mm。
6试样制备与保存
6.1试样制备
6.1.1大豆
取有代表性样品约500g，用粉碎机（5.6）粉碎使其全部通过孔径2.0mm样品筛（5.9），混匀，装人洁净容器作为试样，密封备用。6.1.2豆豉
取有代表性样品约500g，用组织捣碎机（5.7)擒碎，混匀，装人洁净容器作为试样，密封备用。6.2试样保存
粉碎试样于4℃以下保存。试样制备过程中，应防止样品污染或组分变化。7操作步骤
7.1提取
称5g（精确到0.01g）试样于250mL具塞三角瓶中，加90mL90%甲醇溶液（4.4）.置于超声波清洗器（5.4）中60℃提取30min，在离心机（5.5）中10000r/min离心10min，上清液转移至250mL浓缩瓶（5.8）中，残渣再加人60mL90%甲醇溶液进行提取，上清液也转人250mL浓缩瓶，在旋转蒸发器（5.3）60℃浓缩至约40mL。浓缩液转人50mL容量瓶，用10%甲醇溶液（4.6）冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1mL提取液通过0.45μm滤膜（4.16），供高效液相色谱仪测定。7.2色谱参考条件
色谱参考条件如下：
a）色谱柱：RPCi：柱（250mm×4.6mm5μm）或性能相当的色谱柱；b）流动相：0.1%乙酸溶液（4.7）和0.1%乙酸乙睛溶液（4.8），按表1的规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；
d）柱温：40℃；
波长：260nm；
进样量：20μL。
时间/min
7.3测定
表1梯度洗脱表
0.1%乙酸水溶液/mL
GB/T26625—2011
0.1%乙酸乙腈溶液/mL
参考上述色谱条件（7.2）调节高效液相色谱仪，使大豆异黄酮各组分的色谱峰完全分离。分别吸取20μL适当浓度的大豆异黄酮混合标准工作液（4.15.3）和样液（7.1)进行液相色谱测定，分别得到大豆异黄酮各组分的标准工作液峰面积（A.）和样液大豆异黄酮各组分峰面积（A.）。如果样液中大豆异黄酮某一组分峰面积与标准工作溶液中的该组分峰面积相差较大时，稀释样液或调整标准工作液浓度后再行测定。
在上述色谱条件下，大豆异黄酮各组分的保留时间约为：大豆武8.2min、黄豆黄素8.8min、染料木武11.0min、大豆黄素15.3min、黄豆黄素武元16.3min、染料木素19.4min。标准品的色谱图参见附录A。
7.4空白试验
除不加试样外，按7.1~7.3操作步骤进行测定。8结果计算与表示
8.1大豆异黄酮各组分含量
按式（1)计算试样中大豆异黄酮各组分含量（mg/kg）。X-AXC.xV
-试样中某一大豆异黄酮组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；X
A-一试样提取液中某一大豆异黄酮组分的峰面积；A，大豆异黄酮混合标准工作液中某一组分的峰面积；C.大豆异黄酮混合标准液中某一组分的淤度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V—试样提取液最终定容体积，单位为毫升（mL）：一试样质量，单位为克（g）。
注：计算结果应扣除空白值。
8.2大豆异黄酮总含量
试样大豆异黄酮总含量为各组分之和，按式(2)计算：X-EX.
GB/T26625—2011
式中：
X—试样中总大豆异黄酮含量，单位为毫克每千克（mg/kg）。注：本标准6种异黄已包括大豆中异黄酮的绝大部分组分，可认为是大豆异黄酮总含量8.3结果表示
取两次测定结果绝对差值小于重复性限的平均值为测定结果，单位为毫克每千克（mg/kg），保留三位有效数字。如果两个独立测试结果的绝对差值超过重复性限，应弃去该测试结果。再重新完成两个独立测试。
9精密度
9.1重复性
在重复性条件下，获得的两个独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限。各组分大豆异黄酮含量2.5mg/kg～30mg/kg范围内，其重复性限r计算方程参见附录B。9.2再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R。各组分大豆异黄酮含量2.5mg/kg~30mg/kg范围内，其再现性限R计算方程参见附录B。4
1-—大豆武；
黄豆黄素：
染料木：
大豆黄素：
黄豆黄素武元：
染料木素。
附录A
（资料性附录）
大豆异黄酮标准品液相色谱图
图A.1大豆异黄酮标准色谱图
GB/T26625—2011
GB/T26625—2011
附录B
（资料性附录）
精密度计算
本标准的精密度是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定的要求确定的，其重复性限?和再现性限R以95%的可信度来计算。
重复性限「和再现性限R计算方程组分名称
大豆武
黄豆黄素
染料木武
大豆黄素
黄豆黄素武元
染料木素
含量范围/（mg/kg）
重复性限
r=0.1357m+0.4000
r=0. 127 5m+0. 486 4
r=0. 097 3m+0.704 7
r=0.097 6m+0.806 6
r=0.186 0m+0.2568
r=0.1147m+0.4391
r=0. 124 1m+0. 481 0
r=0.0741m+0.738 9
r0. 122 3m+0. 544 8bZxz.net
= 0. 129 0m-f-0, 185 3
r=0. 098 2m+0. 664 3
0.1147m+0.579 5
注：m为该组分的含量，即该组分两个独立测定结果的算术平均值。再现性限R
R0.2239m0.2762
R-0.1685m+0.3600
R=0.2351m+0.3089
R-0.1841m+0.6578
R-0.1836m+0.4832
R-0.1369m+0.0391
R-0.1598m+0.5105
R-0.164 0m-0.136 8
R=0.161 3m+0.676 2
R-0.0718m+1.2041
R=0.137 0m+0.750 2
R=0.088 5m+0.854 4
参考文献
GB/T26625—2011
［1]GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义
［2]GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）重复性与再现性的基本方法
第2部分：确定标准测量方法
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