GB/T 27531-2011
基本信息
标准号： GB/T 27531-2011
中文名称：病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 27531-2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法
GB/T27531-2011
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标准内容
ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27531—2011
病毒性脑病和视网膜病病原递转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方法
Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)for the pathogen of viral encephalopathy and retinopathy2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会國
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业援出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口I本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。GB/T27531—2011
本标准主要起草人：刘笠、卢体康、何俊强，史秀杰，郑晓聪、贾鹏、叶变优、杨锦舜，TTKONKAcA
1范围
病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方法
GB/T 27531—2011
本标准规定了病案性脑病和视网膜病（viral encephalopathyandretinopathy，VER）病原分离和逆转录案合酶链反应(RT-PCR)检测方法：本标准适用手E我病原的流行病学调查，诊断，检疫和监划。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。显注日期的引用文件，仅注日期的版本适用下本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修致单)适用上本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略诺适用于本文件。
CPE:细胞病变(cytopathic effect)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexader:yltrimethyammoniumbromide）DEPC:焦碳酸Z二酯（diethypyrocarhonate）EB:漠化乙锭(ethidium bromide)EDTAZ二胺四乙酸(ethylecncdiaminetetraaceticacid)HEPES，羟乙基啄嗪乙硫磺酸_4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-cthancsulfonicacidRNA,核糖核酸(ribonucleic acid)RNasin：核酸酶抑制剂（ribonuclcascinhihitor）VER：病毒性脑病和视网膜病（viralcencephalopathyandretinopathy）4试剂和材料
水：符合GB/T6682中.-级水的规格，用DEPC处理以除掉R.VA酶。4.1
4.2VERV病毒参考株。
胰酶-EDTA 混合消化液(见附录 A 中 A, I)。4.4
L-15 培养液(见附录 A 中 A.2)。4.5
SSN-1 细胞系:用 L-15 培养液 25 C培养。4.61
E-1I 细胞系:用 L-15 塔养液 25 T培养。4.7
AMV逆转录酶：20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。RNasin:20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化：4.81
胰蛋白酶。
TTTKANRYKAA
GB/T 27531——2011
4.10Tan：-20℃保存，不妻反复冻融或温度剧烈变化。4. 11 dNTP:含 dCTP,dGTP,dATP.dTTP 各 10 mmol/L.4.12引物：用于RT-1CR反应的引物浓度为40umol/L。其序列如下：VERV-F:5'-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3VERV-R.5'-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-34. 13乙醇:分析纯,使用前预冷到一20 ℃,4. 14氯仿:分析纯。
4.15矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。4.16分子量标准。
5器材和设备
5.196孔细胞培养板。
5. 2倒置显微镜。
5.3恒温培养箱。
5.4菩通冰箱和超低温冰箱。
5.5组织研磨器（研磨器处理参见附录B)。5.6离心机和离心管(离心管处理参见附录B)。5.7 PCR扩增仪。
5.8 水平电泳仪。
5.9微量移液器及吸头(吸头处理参见附录B),5.10紫外照射仪或凝胶成像仪：5.11制冰机。
6VERV的分离
6.1采样
待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm-6cm的鱼齿取头部和内脏（包括肾），体长大于6cm的鱼敢脑、眼、弹和肾。按GF/T18088的标准采样。6.2样品处理
6. 2. 1 组织处理
用组织研磨器制备组织匀浆，按1：10的最终蒂释度用L-15培养液稀释，稀释液中含有1000IU/mL肯紊和1000g/mL链无素，于15℃下育2h～4h或4℃下孵育6h～~24h。7000r/min离心15nin，收集上清液。
6. 2. 2 病毒分离
细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液。对1：10的组织勾浆上清液再作两次I0倍稀释，然后将1；10.1：100、1：1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24hSSN-1或E-11细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃-20℃吸附0.5h～1h后，加人L-15细胞培养液。个96孔板分别置于20C和23℃培养。设2个阳性对照（接种VERV标准株）和1个空口对照（未接种病毒的细胞）。3
TTTKONYKAA
GB/T 27531—2011
阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每大用倒置显微镜检查。如果接种了被检勾浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行育传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀液的细胞单层培养物冻融一次,以 7 000 r/nin,4 ℃离心15 min,收集上清。将上清液接种到新鲜细胞单层,培养 7 d。每天用倒置显微镜检查。
如果阳性对照也米出现CPE，则应换用SSV-1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查，7VER的RT-PCR检
7.1样品处理
将 450 μL细胞病变悬液冻融后,放人 1. 5 mL的塑料离心管,再加入 450 μL. CTAB 溶液(虹附录 A 中A.3)并混句,25℃用2 h
7.2核酸抽提
在含有样品的塑料高心管中加人600μL抽提液1（见附录4中A.4），用力混合至少30。12000r/min离心5mi小心取上层水相（约800μL)。再加人700μ抽提液2（见附录A中A，5)，用力混合至少30s。12000t/min离心5min，小心取上层水相（约600μL）。再加入一20C预冷的1.5倍以上体积的无水乙醇.例罩数次混勾后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min小心倒去上清被，倒置于吸水纸上，吸千体。37于燥20min或抽真空干燥；最后加10μL水窃解后作为PCR模板。
7.3变性和退火
在PCR管中加入10μL模板和5μL引物（VERV-F和VERV-R各2.5uL).置于7oC反应5 min。立即冰浴，低速离心药5 s,便液体集中在底部。7. 4 cDNA合成
在上述反虚管中继续加人 dNTP 2μL、5倍逆转录酶缓冲液 5μL,RNA抑制剂1μL,逆转录酶1μL、无菌蒸馏水I.5μL，低速离心后,覆盖50μI. 矿物油将PCR管置PCR扩增仪，42℃60min反应制备模板的cDNA，反成结束后.7010min灭活逆转录酶，立即冰浴。
7.5PCR扩增
在上述反应管中再继续加人Ta酶μL,dNTP[μL:反向引物和正向引物各1μI,25 mmo/T的MgCl,（见附录A中A.6）10μL、10倍Taq酶缓冲液（见附录A中A.7)10μL.加水到总体积100 μL.
混勾后低速离心、让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪，先94C4min再开始35次循环(核酸变性 94 ℃ 1 min,引物退火 58 ℃ 1 min,延伸 72 ℃ 1 min),然后 72 下延伸 10 min,最后4 ℃保温。bZxz.net
7. 6 设立对照
7.6.1在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7.6.2取含有已知VERV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照，7.6.3采用未接种病毒的正常SSN-1细胞脑抽提核酸作为阴性对照。3
TTTKAONYKACA
G3/T27531—2011
7.6.4取等体积的水代替模板作为空白对照，7.7琼脂綫电泳
用 TBE(见附录 A 中 A. 8)电泳缓冲羧配制 1. 5%的脂糖(含 1 μg/ mL EB,见附录 A 中 A. 9)平板，将单板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好灌没胶面。将6μI.PCR扩增产物和2μL溴酚蓝指示剂液（见附录A中A.10)混后加人孔内。在电泳时使用核酸分了盘标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h，当澳酚蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7. 8结果判定
7.8.1用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如阳性对照出现一条127bP的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带，则表明反成体系正常。7.8.2待测样品电泳后在相应427bpDNA位置上有带者，取PCR扩增产物进行测序，同参考序列(参见附录C)进行比较，相似性达到95%以上，则判定为阳性。TTKANYKAcA
胰酶-ETA混合消化液
氧化钠（NaC1.分析纯）
氯化钾(KCI,分析纯）
磷酸一氯钾（KH,PO，+分析纯）磷酸氢二钾（K,HPO,+分析纯）
艺二胺四乙酸(EDTA,分析纯)
胰酶(分析纯)）
双蒸水
过除菌后分装备用：
A.2培养液
附录A
（规范性附录）
试剂及其配制
100 mL
GB/T 27531—20t1
1-15培养基，按说明书的要求配制，然后加入10为的胎牛血清抽滤除菌，4℃保存。开放察统使用时,加人过滤除菌的HEPES.使其在培养液中的终浓度为0.02mnl/I.。A.3CTAB溶液
按2%CTAB,1.4mal/LNaCl,20.0mmol/LEDTA,20.0mal/LTris-HClpH7.5配制。用前加巯基乙到终浓度为 0. 25%。
抽提液1
酚/氯仿/异戊醇,用 1. 0 moI/L pH(7. 9±. 2)Tris 饱和过的重蒸酚 1 氯仿：异戊醇按 25 :24 : 1的比例混合，闭避光保存。
抽提液2
氧伤/异成醇，将氧仿和异戊静接24：1的比例合，髂闭避光保存。A.6MgCl2
25, 0 mmol/1..
Taq 酶用 10 倍浓缩缓冲液
Tris-HCl
500, 0 m101/L pH8. 8
GB/T27531—2011
Tritonx-1uo
500.0mmol/1.
A.8TBE电球缨冲液(5培浓缩液）Tris
加水到
1 000.0 mL
用 5. 0 mol/I. 的 HC1 调 pH 到 &. 0 。A.9EB
用水配制或10.0mg/mL的浓缩液，用时舞10.0mL电泳液或琼脂中加1.0L。A.10
漠酚蓝指示剂溶液（6倍上样缓冲液）溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25名，加双蒸水漆解后移入溴酚蓝溶波中,据匀后定至50mL，加入Na()H溶液1滴，调至蓝色，心
附录B
（资料性附录
耗材去RNA酶的处理方法
本方法适用于本标准中所便用的研磨器、离心音和吸头。GB/T 27531—2011
使用前于 180 ℃干燥 8 h 以上,或用 0. 1%DEPC 水浸泡处理。 DEPC 处理时,先在 37 C浸泡 2 h,然后用灭菌水漂洗数饮，于100 ℃干烤 15 min,去除器血上残余的 DEPC。
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中华人民共和国国家标准
GB/T 27531—2011
病毒性脑病和视网膜病病原递转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方法
Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)for the pathogen of viral encephalopathy and retinopathy2011-11-21发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会國
2012-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业援出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口I本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。GB/T27531—2011
本标准主要起草人：刘笠、卢体康、何俊强，史秀杰，郑晓聪、贾鹏、叶变优、杨锦舜，TTKONKAcA
1范围
病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方法
GB/T 27531—2011
本标准规定了病案性脑病和视网膜病（viral encephalopathyandretinopathy，VER）病原分离和逆转录案合酶链反应(RT-PCR)检测方法：本标准适用手E我病原的流行病学调查，诊断，检疫和监划。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。显注日期的引用文件，仅注日期的版本适用下本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修致单)适用上本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略诺适用于本文件。
CPE:细胞病变(cytopathic effect)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexader:yltrimethyammoniumbromide）DEPC:焦碳酸Z二酯（diethypyrocarhonate）EB:漠化乙锭(ethidium bromide)EDTAZ二胺四乙酸(ethylecncdiaminetetraaceticacid)HEPES，羟乙基啄嗪乙硫磺酸_4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-cthancsulfonicacidRNA,核糖核酸(ribonucleic acid)RNasin：核酸酶抑制剂（ribonuclcascinhihitor）VER：病毒性脑病和视网膜病（viralcencephalopathyandretinopathy）4试剂和材料
水：符合GB/T6682中.-级水的规格，用DEPC处理以除掉R.VA酶。4.1
4.2VERV病毒参考株。
胰酶-EDTA 混合消化液(见附录 A 中 A, I)。4.4
L-15 培养液(见附录 A 中 A.2)。4.5
SSN-1 细胞系:用 L-15 培养液 25 C培养。4.61
E-1I 细胞系:用 L-15 塔养液 25 T培养。4.7
AMV逆转录酶：20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。RNasin:20U/μL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化：4.81
胰蛋白酶。
TTTKANRYKAA
GB/T 27531——2011
4.10Tan：-20℃保存，不妻反复冻融或温度剧烈变化。4. 11 dNTP:含 dCTP,dGTP,dATP.dTTP 各 10 mmol/L.4.12引物：用于RT-1CR反应的引物浓度为40umol/L。其序列如下：VERV-F:5'-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3VERV-R.5'-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-34. 13乙醇:分析纯,使用前预冷到一20 ℃,4. 14氯仿:分析纯。
4.15矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。4.16分子量标准。
5器材和设备
5.196孔细胞培养板。
5. 2倒置显微镜。
5.3恒温培养箱。
5.4菩通冰箱和超低温冰箱。
5.5组织研磨器（研磨器处理参见附录B)。5.6离心机和离心管(离心管处理参见附录B)。5.7 PCR扩增仪。
5.8 水平电泳仪。
5.9微量移液器及吸头(吸头处理参见附录B),5.10紫外照射仪或凝胶成像仪：5.11制冰机。
6VERV的分离
6.1采样
待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm-6cm的鱼齿取头部和内脏（包括肾），体长大于6cm的鱼敢脑、眼、弹和肾。按GF/T18088的标准采样。6.2样品处理
6. 2. 1 组织处理
用组织研磨器制备组织匀浆，按1：10的最终蒂释度用L-15培养液稀释，稀释液中含有1000IU/mL肯紊和1000g/mL链无素，于15℃下育2h～4h或4℃下孵育6h～~24h。7000r/min离心15nin，收集上清液。
6. 2. 2 病毒分离
细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液。对1：10的组织勾浆上清液再作两次I0倍稀释，然后将1；10.1：100、1：1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24hSSN-1或E-11细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃-20℃吸附0.5h～1h后，加人L-15细胞培养液。个96孔板分别置于20C和23℃培养。设2个阳性对照（接种VERV标准株）和1个空口对照（未接种病毒的细胞）。3
TTTKONYKAA
GB/T 27531—2011
阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每大用倒置显微镜检查。如果接种了被检勾浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行育传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀液的细胞单层培养物冻融一次,以 7 000 r/nin,4 ℃离心15 min,收集上清。将上清液接种到新鲜细胞单层,培养 7 d。每天用倒置显微镜检查。
如果阳性对照也米出现CPE，则应换用SSV-1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查，7VER的RT-PCR检
7.1样品处理
将 450 μL细胞病变悬液冻融后,放人 1. 5 mL的塑料离心管,再加入 450 μL. CTAB 溶液(虹附录 A 中A.3)并混句,25℃用2 h
7.2核酸抽提
在含有样品的塑料高心管中加人600μL抽提液1（见附录4中A.4），用力混合至少30。12000r/min离心5mi小心取上层水相（约800μL)。再加人700μ抽提液2（见附录A中A，5)，用力混合至少30s。12000t/min离心5min，小心取上层水相（约600μL）。再加入一20C预冷的1.5倍以上体积的无水乙醇.例罩数次混勾后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min小心倒去上清被，倒置于吸水纸上，吸千体。37于燥20min或抽真空干燥；最后加10μL水窃解后作为PCR模板。
7.3变性和退火
在PCR管中加入10μL模板和5μL引物（VERV-F和VERV-R各2.5uL).置于7oC反应5 min。立即冰浴，低速离心药5 s,便液体集中在底部。7. 4 cDNA合成
在上述反虚管中继续加人 dNTP 2μL、5倍逆转录酶缓冲液 5μL,RNA抑制剂1μL,逆转录酶1μL、无菌蒸馏水I.5μL，低速离心后,覆盖50μI. 矿物油将PCR管置PCR扩增仪，42℃60min反应制备模板的cDNA，反成结束后.7010min灭活逆转录酶，立即冰浴。
7.5PCR扩增
在上述反应管中再继续加人Ta酶μL,dNTP[μL:反向引物和正向引物各1μI,25 mmo/T的MgCl,（见附录A中A.6）10μL、10倍Taq酶缓冲液（见附录A中A.7)10μL.加水到总体积100 μL.
混勾后低速离心、让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪，先94C4min再开始35次循环(核酸变性 94 ℃ 1 min,引物退火 58 ℃ 1 min,延伸 72 ℃ 1 min),然后 72 下延伸 10 min,最后4 ℃保温。bZxz.net
7. 6 设立对照
7.6.1在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7.6.2取含有已知VERV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照，7.6.3采用未接种病毒的正常SSN-1细胞脑抽提核酸作为阴性对照。3
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G3/T27531—2011
7.6.4取等体积的水代替模板作为空白对照，7.7琼脂綫电泳
用 TBE(见附录 A 中 A. 8)电泳缓冲羧配制 1. 5%的脂糖(含 1 μg/ mL EB,见附录 A 中 A. 9)平板，将单板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好灌没胶面。将6μI.PCR扩增产物和2μL溴酚蓝指示剂液（见附录A中A.10)混后加人孔内。在电泳时使用核酸分了盘标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h，当澳酚蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7. 8结果判定
7.8.1用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如阳性对照出现一条127bP的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带，则表明反成体系正常。7.8.2待测样品电泳后在相应427bpDNA位置上有带者，取PCR扩增产物进行测序，同参考序列(参见附录C)进行比较，相似性达到95%以上，则判定为阳性。TTKANYKAcA
胰酶-ETA混合消化液
氧化钠（NaC1.分析纯）
氯化钾(KCI,分析纯）
磷酸一氯钾（KH,PO，+分析纯）磷酸氢二钾（K,HPO,+分析纯）
艺二胺四乙酸(EDTA,分析纯)
胰酶(分析纯)）
双蒸水
过除菌后分装备用：
A.2培养液
附录A
（规范性附录）
试剂及其配制
100 mL
GB/T 27531—20t1
1-15培养基，按说明书的要求配制，然后加入10为的胎牛血清抽滤除菌，4℃保存。开放察统使用时,加人过滤除菌的HEPES.使其在培养液中的终浓度为0.02mnl/I.。A.3CTAB溶液
按2%CTAB,1.4mal/LNaCl,20.0mmol/LEDTA,20.0mal/LTris-HClpH7.5配制。用前加巯基乙到终浓度为 0. 25%。
抽提液1
酚/氯仿/异戊醇,用 1. 0 moI/L pH(7. 9±. 2)Tris 饱和过的重蒸酚 1 氯仿：异戊醇按 25 :24 : 1的比例混合，闭避光保存。
抽提液2
氧伤/异成醇，将氧仿和异戊静接24：1的比例合，髂闭避光保存。A.6MgCl2
25, 0 mmol/1..
Taq 酶用 10 倍浓缩缓冲液
Tris-HCl
500, 0 m101/L pH8. 8
GB/T27531—2011
Tritonx-1uo
500.0mmol/1.
A.8TBE电球缨冲液(5培浓缩液）Tris
加水到
1 000.0 mL
用 5. 0 mol/I. 的 HC1 调 pH 到 &. 0 。A.9EB
用水配制或10.0mg/mL的浓缩液，用时舞10.0mL电泳液或琼脂中加1.0L。A.10
漠酚蓝指示剂溶液（6倍上样缓冲液）溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25名，加双蒸水漆解后移入溴酚蓝溶波中,据匀后定至50mL，加入Na()H溶液1滴，调至蓝色，心
附录B
（资料性附录
耗材去RNA酶的处理方法
本方法适用于本标准中所便用的研磨器、离心音和吸头。GB/T 27531—2011
使用前于 180 ℃干燥 8 h 以上,或用 0. 1%DEPC 水浸泡处理。 DEPC 处理时,先在 37 C浸泡 2 h,然后用灭菌水漂洗数饮，于100 ℃干烤 15 min,去除器血上残余的 DEPC。
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