SC/T 7219.1-2015 三代虫病诊断规程 第1部分 大西洋鲑三代虫病 SC/T7219.1-2015 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

1CS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7219.1-2015
三代虫病诊断规程
第1部分：大西洋鲑三代虫病
Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis -Part l: Infection with Gyrodactylus salaris2015-02-09发布
2015-05-01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7219《-代虫病诊断规程》为系列标准：第1部分：大西洋鲤三代出病；
第2部分：皖一代虫病；
第3部分：鲢代虫病；
第4部分：中型=代业病；
第5部分:细锚三代虫病；
-第6部分;小林三代鬼病；
.TTETT.
本部分为SC/T7219的第1部分，
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草SC/T 7219. 1—2015
请注意本文件的荣些内容可能涉及专利。不文件的发布机构不承担认别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管埋局提出。本部分由全国水产标推化技术委员会（SAC/TC156)归口。本部分越草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人李文祥、E桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。1
1范围
三代虫病诊断规程
第1部分;大西洋鲑三代虫病
SC/T 7219. 1—2015
本部分规定了大西洋鲑三代虫病的感染对象与临床症状，大西洋鲤三代虫（Gurodartussalari）的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及大西洋壁一代出病的综合判定。本部分适用于鲜、鳟色类大西洋鲑三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫：2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修收单）适用于本文件。CB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料
3.1水：符合GB/T6682中一级水的规定。3.2乙醇：分析纯。
3.3Taq酶：—20℃保存，避免反复冻融，3.4dNTPs：含dATP、dTIP、dGTP和dTP各10mmal/I.3.5上游引物：5-TTTCCGTAGGIGAACCT-3'，3. 6 下游引物:5'-TCCTCGCTTAGTGATA-3'3. 7 矿物油:不含 DNA 酶和 RNA 酶。3.8DNAmarker2000:2000tbp.1000bp.750bp.500bp.250bp100hp.3.9其他试剂现附录A。
4仪器和设备
解剖盘、剪刀、镊子、解剖针和手术刀。4.2
体视显微镜利带测微标尺的光学微镜。4.3盖玻片、裁玻片和培养血。
4.4电子大半。
4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6普通冰箱和超低温冰箱
4.7微量移液器。
4.8PCR扩增仪。
4.9离心管和PCR管。
紫外透射。
4.11水平电泳系统。
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5感染对象与临床症状
5.1感染对象
大西洋鲜一代虫能感染好生和养殖大西洋链（Sutmosular）、褐缚（Sa.lmntrutta）.还有虹尊（Omcorhyhuymgkiss）北极红点鲢（Selvelinusatpinus）溪红点鲢（SJnntnatis）、湖红点鲜（Snamuyciush)和尚角(Thymaffusthymalius)等5.2临床症状
大四洋鲜一代虫十要寄牛于体表，病鱼常出现蹭擦池壁、跃尚水面的行为；有些疯色反应巡钝，常在水流缓慢的地方出现，体表因黏液增多变成淡灰色，背鳍，尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂6三代虫采集与固定
6.1病鱼采集
行细观察待检色类的临床症状和行为.捞取具有典型症状的色类，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合C/7103的规定。
6.2三代虫样品的采集
6.2.1现场采集
剪取鳍条或刮取部分体表黏液、置于载玻片工，瀚加数滴清水，置于体视显微镜下观察，用解剖针将一代虫从鳍条或体表黏液中分离，用吸管吸出，放在盛有清水的培养血中，每尾病鱼至少采华成虫10茶。
6.2.2固定病鱼中的采集
剪取病鱼鳍条放在载玻片1：.逐滴加入自米水浸泡1Cmin，置十体视显微镜下观察。发现一代出后，川解剖针将出体分离，放在盛有清水的培养血中。同时.镜检固定病角所用察器底部的沉淀物。如发现有从鱼体脱落的一代出.用吸管吸出，放在盛有清水的培养Ⅲ中。6.3三代虫样品的固定与保存
加滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个业体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在羞坡片边缘缓慢吸水，直到水基本吸于为止。加上一滴APG溶液（见附录A.1）到盖玻片缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。
用十形态学鉴定的虫体样木可用70%酒精保存，用于PCR整定的虫体样品可用95坏酒精保存：7大西洋鲑三代虫的鉴定
7.1大西洋鲑三代虫的形态学鉴定人西洋三代出运动如尺嬉；虫体呈长叶形，体长0.5mm～1.0mm，体前有2个头器，无黑色眼点；虫体后端其儿丁质的伞状后吸器.其上有1对锚钩，16个边缘小钩和1根腹联结片：腹联结片上端中部叫陷明显，突起问长度稍短于联结片长；与寄生于链，鳟鱼类的其他2种一代虫的主要区别在于，Cyrodacrytustethis边缘小钩的镰部平几少要更长且弯.thymulli的镰部趾尖与柄部的角度更小可依此进行鉴定。
大西洋鲑·三代出后吸器的铺钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其人小见附录B。如果虫体后吸幕的形态特征和测量大小与附录B符，则可判定为疑似大西洋三代虫。7.2大西洋鲑三代虫的分子检测
7. 2. 1虫体 IXA 的提取
将80%乙醇固定的三代虫（1个出体作为1个样品）充分千燥去除乙醇，置人1.5mL的离心管中，加人500u.DNA抽提缓冲液1（见附录A.4）55℃消化3h，冷却至室漏后加人30)u1NA抽提缀2
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冲液Ⅱ（见附录A.5），操勺.11000g离心10min，收集上清液，然后，加人2倍上清体积的一20℃预冷无水乙醇，1℃下5000g离心10min弃1清液，70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液·空气十燥后溶于10L.TE缓冲液（见附录A.2)，一20℃保存备用。7.2.2TDNA-ITS的FCR扩增
PCR反应体系(25 μI)中,加人 20 rmol/1.的上游引物和下游引物各 1 μL,dNTPs 2μL,MgCl,2. 5μI.,Taq酶缓冲液2. 5 μL,0.5 UTaq酶以及模板基因组 DNA 1L,最后用无菌离子水定容到25 μl. 无热盖加的PCR仪应加矿物油25uL在PCR扩增仪中,91℃预变性4min,再 94℃:30 s*50℃30 s*72℃1min-洪35个循环,最后72℃延伸10min
PCR 扩增时,应设置阴性对照和阳性对照7.2.3PCR产物电泳与测序
取 5L PCR产物,加人 1 uI 漠酚蓝指示剂溶被(见附录 A.),混勾:用 1. 0为 琼脂糖（含(.5μg/ImLEB)于TAE缓冲溶液(见附录A.7)中电泳分离，同时设置DVA分了量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约130bp的目的条带。如存在目的条带,则取P(R扩增产物测序，其序列参见附录C，序列相似性在99%以上者，判定虫体为人西洋鲜三代虫。8综合判定
8.1大西洋鲑三代虫的判定
如果在显徽镜下观察到鲑、鱼类的鳍条或体表虫体符合7.1的形态特征和测量数据，则判断为疑似大西洋一代出；并根据7.2的方法对PCR扩增产物测序,与附录C给出的序列进行比对分析，序列相似性在99%以上者，判定虫体为大西洋鲢一代虫。8.2大西洋鲑三代虫病的判定
鲢、鳟鱼类感染大两洋一代出·且病鱼临床症状符合5.2描述，则判定为大西洋鲢三代虫病。3
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附录A
(规范性附录）
试剂及其配制
本附录所有试剂,除特别注明外,均采用分析纯的试剂。A.1AIG溶液
将饱和的萨味酸铵溶液和油照1：1的比例混合，A.2TE缓冲液
1 mL 1ris HCl(limol/L-pH8. 0)和 0.2ml. EDTA(0. 5 mol/L,pH8.0)混合,加无菌去离子水穿至100mL，高火菌后4℃保存。A.310%SDS溶液
10gSDS溶于90mL蒸馏水中，68℃助溶用盐酸调pH至7.2.最后加熊馏水定容至100mL.室温保荐，
A4DNA抽提缓冲液I
400μLTE缀冲液.16μL蛋海K(5mg/ml)和20μL10%SLS的混合溶液A5DNA抽提缓冲液I
按TrisHC1溶液饱和过的亚蒸酚、氯伤、片必醇以25：24：1的比例混合，密闭避光1保存。A6Tag酶缓冲液（10倍PCRbuffer)0.5 mol/ L pH 8. 8 的 Tris -HCl、0. 5 mol/L 的氯化钾(KCl)和 1%的 TritonX-10c 的混合溶液A.7TAE电泳缓冲液(50倍)
242.0gTris碱.37.2\Na：上TTA·2H()混台·然后加80)mI.的去离子水充分搅拌溶解：再加入 57.1ml.的冰乙酸，充分混勾.加去离予水定容至1L室温保存。A.8核酸染色剂(ethidium bromide,EB)用水配制放10.0mg/mI.的浓缩液。使用时.每30.0ml.电泳液或琼脂中加1.0uL的EB，A.9溴酚蓝指示剂溶液
漠酚蓝100mg·加双蒸水5ml.在室温下过夜。待溶解后再称取熊糖25g加双蒸水溶解后移入漠酚监溶液中，摇勺后.加双蒸水定容至50mI加人氧氧化钠（NaOH)落液「滴，调至蓝色。-iiiKwcutKAca
附录B
（规范性附录】
大西洋鲑三代虫后吸器的形态测量B.1大西洋鲑三代虫锚钩的测量部位及大小见图B.110μm
说明：
全长(58.0m85.cm)
钩柄长(42. S rm~-63.9 mm);
c——衔尖长(27.8 μm1~-44. 2 μm);t基部长（15.0μm~32.1μm）。图B.1锚钩的测量部位及大小
B.2大西洋鲢一代虫边缘小钩的测量部位及大小见图B.2。um
说明：
全长（33.0m~15.6m），
部长（.ngm9.um）
柄部长(26.0μm-~38.5 jμm)。图B.2边缘小钩的测量部位及大小SC/ T 7219. 1—2015
SC/T 7219. 1—2015
B.3大西洋三代虫腹联结片的测量部位及大小见图B.3m
说明：
—联结片长（19.5m~31.0gr)
定起间长18.5m;
其部宽度(2.1 pn1--18. 7 um):d-
中间宽度(. 0 μm--15. 5 m);
膜长(12. 5 μm23. μn
—中间总宽度门7. c: un~-35. ,m);g—基总宽魔(2.H Jzm3t.ijm)。3腹联结片的测量部位及大小
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附录C
【资料性附录”
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大西洋鲑三代虫核糖体DNA 内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列人西洋鲜一代虫核糖体IVA内转录间隔区（ITS)扩增产物的参考序列如下，下划线为引物1
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