GB 4789.3-2016
基本信息
标准号： GB 4789.3-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 食品安全 国家标准 食品 微生物学 检验 大肠菌群 计数
标准分类号
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出版信息
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标准简介
GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
GB4789.3-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB4789.3—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验
2016-12-23发布
大肠菌群计数
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB4789.3—2016
本标准代替GB4789.3一2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.32010相比，主要变化如下—增加了检验原理；
修改了适用范围；
修改了典型菌落的形态描述；
修改了第二法平板菌落数的选择；修改了第二法证实试验；
一修改了第二法平板计数的报告。I
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
天肠菌群计数
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法GB 4789.3—2016
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
2术语和定义
大肠菌群
Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2
最可能数
Mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。3检验原理
MPN法
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数3.2平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃土1℃。
冰箱：2℃～5℃。
恒温水浴箱：46℃土1℃。
天平：感量0.1g。
均质器。
振荡器。
无菌吸管：1mL（具0.01lmL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500mL。
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。4.11
菌落计数器。
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白陈（laurylsulfatetryptose，LST)肉汤：见A.l。煌绿乳糖胆盐（brilliantgreenlactosebile，BGLB）肉汤：见A.2。结晶紫中性红胆盐琼脂（violetredbileagar，VRBA）：见A.3。无菌磷酸盐缓冲液：见A.4。
无菌生理盐水：见A.5。
1mol/LNaOH溶液：见A.6。
1mol/LHCI溶液：见A.7。
第一法大肠菌群MPN计数法
检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1检样
25 g (mL胖品-225 mL都释液，均质10倍系列释
迷择适宜3个连继稀释度的样品勾液，接种1S1肉汤普36℃
大肠菌群阴性
24 h48 h
BGLB因汤
36 C11
不产气
VIPN表
药果摄告
18b±2h
大断菌群阳性
大肠菌群MPN计数法检验程序
GB 4789.32016
7操作步骤
7.1样品的稀释
GB4789.3—2016
7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min2min，或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
7.1.3样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节7.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注人9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。7.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。7.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST)肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36.℃土1℃培养24h土2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h土2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h士2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3复发酵试验（证实试验）
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃土1℃培养48h土2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
第二法大肠菌群平板计数法
8检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。3
操作步骤
样品的稀释
按7.1进行。
9.2平板计数
25g（ml.样品225mT.释液，均质[0倍系刻稀释
选择2个3个适亢稀释度的样品勾液，倾注VRBA平板3 cl1 c
18 h--24h
计数典型和可疑菌游
RGT.R肉汤
36 ±1 1.
24 h--18 h
报告结果
图2大肠菌群平板计数法检验程序GB4789.3—2016
9.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加无菌平血作空白对照。9.2.2及时将15mL～20mL融化并恒温至46℃C的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平Ⅲ，将培养基与样液充分混勾，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。9.3平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。9.4
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃土1℃培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
GB 4789.3—2016
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-样品稀释液1mL.在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10°/g（mL）6.0X10°CFU/g（mL）。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算，
月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST)肉汤成分
胰蛋白陈或胰酪陈
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO）
磷酸二氢钾（KH,PO）
月桂基硫酸钠
蒸馏水
附录A
培养基和试剂
1000mL
GB4789.3—2016
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH至6.8土0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL121℃高压灭菌15min。
A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤
蛋白陈
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌绿水溶液
蒸馏水
将蛋白陈、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加人牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0~7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.2士0.1再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)
蛋白陈
酵母膏
氯化钠
胆盐或3号胆盐
中性红
结晶紫
蒸馏水
15g~18g
1000mL
GB4789.3—2016
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH至7.4土0.1。煮沸2min，将培养基融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.4
磷酸盐缓冲液Www.bzxZ.net
磷酸二氢钾（KH,PO）
蒸馏水
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2士0.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.5
无菌生理盐水
氯化钠
蒸馏水
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.6
1mol/LNaOH溶液
蒸馏水
称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。40.0g
1000mL
A.71mol/LHCI溶液
蒸馏水
移取浓盐酸90mL.用无菌蒸馏水稀释至1000mL。90ml
1000mL
GB4789.3—2016
附录B
大肠菌群最可能数（MPN)检索表大肠菌群最可能数（MPN)检索表B.1
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数（MPN)的检索见表B.1。表B.1
阳性管数
大肠菌群最可能数（MPN)检索表95%可信限
阳性管数
GB4789.3—2016
95%可信限
注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。420
注2：表内所列检样量如改用1g(mL）.0.1g(mL）和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL）.0.001g（mL）和0.0001g（mL）时.则表内数字应相应增高10倍.其余类推。9
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食品安全国家标准
食品微生物学检验
2016-12-23发布
大肠菌群计数
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB4789.3—2016
本标准代替GB4789.3一2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.32010相比，主要变化如下—增加了检验原理；
修改了适用范围；
修改了典型菌落的形态描述；
修改了第二法平板菌落数的选择；修改了第二法证实试验；
一修改了第二法平板计数的报告。I
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
天肠菌群计数
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法GB 4789.3—2016
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
2术语和定义
大肠菌群
Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2
最可能数
Mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。3检验原理
MPN法
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数3.2平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃土1℃。
冰箱：2℃～5℃。
恒温水浴箱：46℃土1℃。
天平：感量0.1g。
均质器。
振荡器。
无菌吸管：1mL（具0.01lmL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500mL。
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。4.11
菌落计数器。
培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白陈（laurylsulfatetryptose，LST)肉汤：见A.l。煌绿乳糖胆盐（brilliantgreenlactosebile，BGLB）肉汤：见A.2。结晶紫中性红胆盐琼脂（violetredbileagar，VRBA）：见A.3。无菌磷酸盐缓冲液：见A.4。
无菌生理盐水：见A.5。
1mol/LNaOH溶液：见A.6。
1mol/LHCI溶液：见A.7。
第一法大肠菌群MPN计数法
检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1检样
25 g (mL胖品-225 mL都释液，均质10倍系列释
迷择适宜3个连继稀释度的样品勾液，接种1S1肉汤普36℃
大肠菌群阴性
24 h48 h
BGLB因汤
36 C11
不产气
VIPN表
药果摄告
18b±2h
大断菌群阳性
大肠菌群MPN计数法检验程序
GB 4789.32016
7操作步骤
7.1样品的稀释
GB4789.3—2016
7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min2min，或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
7.1.3样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节7.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注人9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。7.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。7.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST)肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36.℃土1℃培养24h土2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h土2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h士2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3复发酵试验（证实试验）
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃土1℃培养48h土2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
第二法大肠菌群平板计数法
8检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。3
操作步骤
样品的稀释
按7.1进行。
9.2平板计数
25g（ml.样品225mT.释液，均质[0倍系刻稀释
选择2个3个适亢稀释度的样品勾液，倾注VRBA平板3 cl1 c
18 h--24h
计数典型和可疑菌游
RGT.R肉汤
36 ±1 1.
24 h--18 h
报告结果
图2大肠菌群平板计数法检验程序GB4789.3—2016
9.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加无菌平血作空白对照。9.2.2及时将15mL～20mL融化并恒温至46℃C的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平Ⅲ，将培养基与样液充分混勾，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。9.3平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。9.4
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃土1℃培养24h48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气即可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群平板计数的报告
GB 4789.3—2016
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-样品稀释液1mL.在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10°/g（mL）6.0X10°CFU/g（mL）。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算，
月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST)肉汤成分
胰蛋白陈或胰酪陈
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO）
磷酸二氢钾（KH,PO）
月桂基硫酸钠
蒸馏水
附录A
培养基和试剂
1000mL
GB4789.3—2016
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH至6.8土0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL121℃高压灭菌15min。
A.2煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤
蛋白陈
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液0.1%煌绿水溶液
蒸馏水
将蛋白陈、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加人牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0~7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.2士0.1再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)
蛋白陈
酵母膏
氯化钠
胆盐或3号胆盐
中性红
结晶紫
蒸馏水
15g~18g
1000mL
GB4789.3—2016
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH至7.4土0.1。煮沸2min，将培养基融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。A.4
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磷酸二氢钾（KH,PO）
蒸馏水
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2士0.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。A.5
无菌生理盐水
氯化钠
蒸馏水
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.6
1mol/LNaOH溶液
蒸馏水
称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。40.0g
1000mL
A.71mol/LHCI溶液
蒸馏水
移取浓盐酸90mL.用无菌蒸馏水稀释至1000mL。90ml
1000mL
GB4789.3—2016
附录B
大肠菌群最可能数（MPN)检索表大肠菌群最可能数（MPN)检索表B.1
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数（MPN)的检索见表B.1。表B.1
阳性管数
大肠菌群最可能数（MPN)检索表95%可信限
阳性管数
GB4789.3—2016
95%可信限
注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。420
注2：表内所列检样量如改用1g(mL）.0.1g(mL）和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL）.0.001g（mL）和0.0001g（mL）时.则表内数字应相应增高10倍.其余类推。9
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