GB 5009.89-2016
基本信息
标准号： GB 5009.89-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB 5009.89-2016 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
GB5009.89-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.89—2016
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.89—2016
本标准代替GB/T5009.89—2003《食品中烟酸的测定》、GB5413.152010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品种烟酸和烟酰胺的测定》和GB/T9695.25-2008《肉与肉制品维生素PP含量测定》。
本标准与GB5413.15—2010相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定”；调整了试剂顺序和格式；
修改并细化了适用于不同食品种类的前处理方法（第一法）；—一增加了标准溶液浓度校正方法（第二法）；一重新评估了检出限，增加了定量限。I
1范围
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法GB5009.89—2016
本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。第一法
微生物法
2原理
烟酸（烟酰胺）是植物乳杆菌Lactobacillμsplantarum（ATCC8o14)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，利用植物乳杆菌对烟酸和烟酰胺的特异性，在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长形成的光密度来测定烟酸和烟酰胺的含量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。
3.1菌种
植物乳杆菌Lactobacillμusplantarum（ATCC8014），或其他有效标准菌株3.2试剂
盐酸（HCI)
3.2.2氢氧化钠（NaOH）。
3.2.3氯化钠(NaCI)。
3.2.4浓硫酸（H,SO,）。
乙醇(C,H,OH)
试剂配制
盐酸溶液（1mol/L）：吸取83mL盐酸，于1000mL烧杯中，加917mL水，混匀3.3.2盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取盐酸溶液（3.3.1)10mL，加水溶解至100mL。氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠于1000mL烧杯中，加水溶解并稀释至3.3.3
1000mL，混匀。
GB 5009.89—2016
3.3.4氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：吸取氢氧化钠溶液（3.3.3)10mL.加水溶解至100mL。3.3.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠，溶解于1000mL水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。
3.3.6乙醇溶液（25%）：量取200mL无水乙醇与800mL水混勺。3.3.7硫酸溶液（1mol/L）：于2000mL烧杯中先注人700mL水，吸取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒人水中，用水稀释到1000mL。
3.4培养基
3.4.1乳酸杆菌琼脂培养基：可按A.1配制。3.4.2乳酸杆菌肉汤培养基：可按A.2配制。3.4.3烟酸测定用培养基：可按A.3配制注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制3.5标准品
烟酸（C.H，NO）：纯度≥99.5%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.6标准溶液配制
3.6.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0mg烟酸标准品，用乙醇溶液溶解并移至500mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100μg烟酸，3.6.2烟酸标准中间液（1g/mL）：准确吸取1.0mL烟酸标准储备液（3.6.1）置于100mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于1ug烟酸3.6.3烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00mL烟酸标准中间液（3.6.2）置于50mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100ng烟酸。4仪器和设备
天平：感量分别为0.01g和0.1mg。4.1
均质设备：用于试样的均质化
恒温培养箱：36℃土1℃。
涡旋振荡器。
压力蒸汽消毒器：121℃（0.10MPa~0.12MPa）。离心机：转速≥2000r/min。
pH计：精度士0.01。
分光光度计。
超净工作台。
超声波振荡器。
注：玻璃仪器使用前.用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后烘干，于170℃干热3h后使用。5分析步骤
5.1储备菌种的制备
GB5009.89—2016
将菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum（ATCC8014)转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃士1℃恒温培养箱中培养20h～24h，取出后放人2℃～4℃冰箱中保存。每月至少传种一次，作为储备菌株保存
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃士1℃恒温培养箱中培养20h24h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代～3代以保证菌株活力。
5.2接种液的制备
试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基中，于36℃士1℃恒温培养箱中培养6h18h。在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。加人10mL已灭菌的生理盐水重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，去上清液。重复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水，使其充分混合均匀制成混悬液，备用。用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9%生理盐水为参比，读取该菌悬液的透光值，用0.9%生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60%～80%之间。立即使用。
5.3试样制备
谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm～0.5mm）；乳粉、米粉等试样混匀；肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需勾浆混匀；液体试样用前振摇混合。如不能马上检测，于4℃冰箱保存。5.4试样提取
准确称取约烟酸试样，一般乳类、新鲜果蔬试样2g～5g（精确至0.01g）：谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2g~1g（精确至0.01g），液态试样5g；乳粉、米粉等准确称取适量试样2g（精确至0.01g）；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g；食品0.2g1g；液体饮料或流质、半流质试样5g～10g于100mL锥形瓶中，加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液。在121℃下，水解30min后冷却至室温。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0~6.5.再用0.1mol/L盐酸调pH至4.5±0.1，用水定容至100mL，用无灰滤纸过滤，滤液备用。5.5稀释
根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释（f），使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0ng～500.0ng范围内
5.6测定系列管制备
5.6.1标准系列管
取试管分别加人烟酸标准工作液0.00mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL和5.00mL，补水至5.0mL，相当于标准系列管中烟酸含量为0.0ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400ng、500ng。加5.0mL烟酸测定用培养基，见表1。混匀。每个标准点应制备3管。
GB5009.89—2016
表1标准曲线管的制作
试管号（No.）
蒸馏水/mL
标准溶液*/ml
培养基/mL
*试管No.1~2中不添加标准溶液；2中滴加菌液；No.3~10中添加标准品溶液的浓度依次增高。3个重复。5.6.2试样系列管
取4支试管，分别加人1.0mL、2.0mL，3.0mL、4.0mL试样提取液，补水至5.0mL，加人5.0mL烟酸测定用培养液，见表2。混匀，每个浓度做3个重复表2试样管的制作
试管号（No.）
蒸馏水/mL
样品/mL
培养基/mL
5.6.3灭菌
将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞，于121℃（0.10MPa～0.12MPa)高压灭菌5min。灭菌完成后，迅速冷却，备用。5.7培养
5.7.1接种：在无菌操作条件下，将接种液转入无菌滴管，向每支测定管接种一滴。5.7.2培养：将加完菌液的试管置于36℃土1℃恒温培养箱中培养16h～24h，直至获得最大浊度，即再培养2h浊度无明显变化。另准备一支标准0管（含0.0ng烟酸）不接种作为0对照管。5.8测定
用厚度为1cm比色杯，在波长550nm条件下读取光密度值，将培养好的测定管用涡旋混器混匀。以未接种0对照管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。取出最高浓度标准曲线管振荡5s，测定光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。5.9标准曲线的制作
以标准系列管烟酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，也可对各个标准点做拟合曲线。各个标准点3管之间的光密度值的相对标准偏差应小于10%，如果某一标准点3支试样管中有2支烟酸含量落在50ng～500ng范围内，且该两管之间折合为每毫升试样提取液中烟酸含量的偏差小于10%，则该结果可用，如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%，则该点舍去，不参与标准曲线的绘制。
6分析结果的表述
GB 5009.89—2016
试样结果计算：从标准曲线查得试样系列管中烟酸的相应含量（c），按式（1)进行结果计算。测定液浓度按式(1)计算：
pxvixf
式中：
试样中烟酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；..1)
试样系列管折合为试样提取液中烟酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；试样提取液稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）；
折算成每百克试样中烟酸毫克数的换算系数。结果保留两位有效数字。
7精密度
普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%：强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。8其他
按样品种类将待测试样稀释到线性范围内再对样品进行测试本标准试管法线性范围50ng/mL～500ng/mL；天然类等含量较低的食品试样称样量为5g时，检出限为0.05mg/100g，定量限为0.1mg/100g；强化食品等含量较高的食品试样称样量为1g时，检出限为0.25mg/100g，定量限为0.5mg/100g。第二法
高效液相色谱法
9原理
高蛋白样品经沉淀蛋白质，高淀粉样品经淀粉酶酶解，在弱酸性环境下超声波振荡提取，以C1：色谱柱分离，在紫外检测器检测261nm波长处检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，计算试样中烟酸和烟酰胺含量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水10.1
10.1.1盐酸（HCI)：优级纯。
氢氧化钠（NaOH)：优级纯。
高氯酸（HCIO）：体积分数为60%优级纯10.1.37
甲醇（CHOH）：色谱纯。
异丙醇(CHO)：色谱纯。
庚烷磺酸钠（C,HisNaO,S)：色谱纯。淀粉酶：酶活力≥1.5p/mg
10.2试剂配制
GB5009.89—2016
盐酸（5.0mol/L）：用量筒量取415mL盐酸，于1000mL烧杯中，加585mL水，混匀盐酸（0.1mol/L）：用移液管吸取8.3mL盐酸，于1000mL烧杯中，加991.7mL水，混匀。氢氧化钠（5.0mol/L）：称取200g氢氧化钠（3.2.2）于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。
10.2.4氢氧化钠（0.1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠（3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。
10.2.5流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经0.45μm膜过滤。10.3烟酸和烟酰胺标准溶液
烟酸（CH,NOz）和烟酰胺（C,H,NzO)：纯度>99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
烟酸和烟酰胺标准储备液（1.000mg/mL）：准确称取烟酸及烟酰胺标准品各0.05g（精确到0.1mg），分别置于100mL容量瓶中，用0.1mo1/L盐酸溶解，定容至刻度.混匀（4℃冰箱中可保存1个月）。
注：标准储备液配制完以后，需要进行浓度校正，校正方法见附录B。10.3.2烟酸和烟酰胺标准混合中间液（100.0μg/mL）：准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液（10.3.1)各10.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。临用前配制。10.3.3烟酸和烟酰胺标准混合工作液：分别准确吸取标准混合中间液（10.3.2）1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，得到浓度分别为1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL，10.0μg/mL、20.0μg/mL的标准混合工作液。临用前配制11
仪器和设备
天平：感量0.1mg。
恒箱培养箱：30℃~80℃。
超声波振荡器。
11.4pH计：精度土0.01。
11.5高效液相色谱仪：带紫外检测器11.6
一次性微孔滤头：带0.45um微孔滤膜分析步骤
12.1试样制备与处理
非粉状固态试样粉碎并混合均勾；液态试样摇匀。6
GB5009.89—2016
12.1.1淀粉类和含淀粉的食品（即食谷物、面包、饼干、面条、小麦粉和杂粮粉等制品）称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），加人约25mL45℃～50℃的水，称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g）于150mL锥形瓶中，加人约0.5g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞.置于50℃～60℃的培养箱内培养约30min，取出冷却至室温。注：如果条件允许，建议酶解时采用55℃土5℃水浴振摇。12.1.2不含淀粉的食品（调制乳、调制乳粉、饮料类、固体饮料类、豆粉和豆浆粉等制品）称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），加人约25mL45℃～50℃的水，称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g）于150mL锥形瓶中.置于超声波振荡器中振荡约10min以上充分溶解，静置5min10min，并冷却至室温。12.1.3提取
待试样溶液降至室温后，用5.0mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节试样溶液的pH至1.7士0.1,放置约2min后，再用5.0mol/L氢氧化钠溶液和0.1mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的pH至4.5土0.1,置于50℃水浴超声波振荡器中振荡10min以上充分提取，冷却至室温后转至100mL容量瓶中.用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于100mL容量瓶中.用水定容至刻度后混匀，经滤纸过滤。滤液再经0.45um微孔滤膜加压过滤，用样品瓶收集，即为试样测定液。注：必要时，试样测定液用水进行适当的稀释（），使试样测定液中烟酸和烟酰胺浓度在1ug/mL20μg/mL范围内。
12.2参考液相色谱条件
参考液相色谱条件列出如下：
色谱柱：Cis（粒径5um，250mmX4.6mm）或具有同等性能的色谱柱：a）
柱温：25℃±0.5℃；
紫外检测器：检测波长为261nm；d)
流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤；流速：1.0mL/min；
f）进样量：10μL或20μL。
12.3测定
12.3.1标准曲线测定
按照已经确立的色谱条件，将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液依次按上述推荐色谱条件进行测定（标准样品色谱图见C.1）。记录各组分的色谱峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。12.3.2试样溶液的测定
将试样测定液按上述推荐色谱条件进样测定。记录各组分色谱峰面积或峰高，根据标准曲线计算出试样测定液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度β。7
分析结果的表述
试样烟酸和烟酰胺含量计算
试样中烟酸或烟酰胺的含量，按式（2)计算：p.xVx100
Xi或2=
式中：
X1成2
试样中烟酸或烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V
试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；试样的质量，单位为克（g）。
注：液态试样中烟酸或烟酰胺含量也可以微克每百毫升（μg/100mL）为单位。13.2
试样中维生素PP的总含量
试样中维生素PP的总含量X.按式(3)计算：X=X+X,X1.008
式中：
试样中维生素PP的总含量，单位为微克每百克（μg/100g）；—试样中烟酸的含量，单位为微克每百克（μg/100g)；试样中烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；烟酰胺转化成烟酸的系数。
结果表述
结果保留到整数。
精密度
GB5009.89—2016
..（2)
··（3)
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
当称样量为5g时，烟酸检出限为30uμg/100g，定量限为100μg/100g，烟酰胺检出限为40μg/100g定量限为120μg/100g。8
乳酸杆菌琼脂培养基
光解陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
聚山梨糖单油酸酯
番茄汁
蒸馏水
附录A
培养基和试剂
1000mL
GB5009.89—2016
先将除琼脂以外的其他成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.8士0.2（20℃～25℃），再加人琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。混合均匀后分装试管，每管10mL。121℃高压灭菌15min，备用。A.2
乳酸杆菌肉汤培养基
光解陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
聚山梨糖单油酸酯
番茄汁
蒸馏水
1000mL
将上述成分溶解于水中，调节pH6.8士0.2（20℃～25℃），分装10mL于试管中121℃高压灭菌15min.备用。
烟酸测定用培养基
1成分
酪蛋白氨基酸
葡萄糖
乙酸钠
L-胱氨酸
DL-色氨酸
盐酸腺嘌呤
盐酸鸟嘌呤
尿嘧啶
盐酸硫胺素
泛酸钙
盐酸吡哆醇
核黄素
P-氨基苯甲酸
生物素
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
硫酸镁
氯化钠
硫酸亚铁
硫酸锰
蒸馏水
注：自行配制烟酸测定培养基时.所有试剂不得含有烟酸。制法
200μg
200μgbzxz.net
400μg
400μg
100μg
1000mL
将上述成分溶解于水中.调pH至6.7土0.2（20℃～25℃），备用GB 5009.89—2016
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食品中烟酸和烟酰胺的测定
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本标准代替GB/T5009.89—2003《食品中烟酸的测定》、GB5413.152010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品种烟酸和烟酰胺的测定》和GB/T9695.25-2008《肉与肉制品维生素PP含量测定》。
本标准与GB5413.15—2010相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定”；调整了试剂顺序和格式；
修改并细化了适用于不同食品种类的前处理方法（第一法）；—一增加了标准溶液浓度校正方法（第二法）；一重新评估了检出限，增加了定量限。I
1范围
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法GB5009.89—2016
本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。第一法
微生物法
2原理
烟酸（烟酰胺）是植物乳杆菌Lactobacillμsplantarum（ATCC8o14)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，利用植物乳杆菌对烟酸和烟酰胺的特异性，在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长形成的光密度来测定烟酸和烟酰胺的含量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。
3.1菌种
植物乳杆菌Lactobacillμusplantarum（ATCC8014），或其他有效标准菌株3.2试剂
盐酸（HCI)
3.2.2氢氧化钠（NaOH）。
3.2.3氯化钠(NaCI)。
3.2.4浓硫酸（H,SO,）。
乙醇(C,H,OH)
试剂配制
盐酸溶液（1mol/L）：吸取83mL盐酸，于1000mL烧杯中，加917mL水，混匀3.3.2盐酸溶液（0.1mol/L）：吸取盐酸溶液（3.3.1)10mL，加水溶解至100mL。氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠于1000mL烧杯中，加水溶解并稀释至3.3.3
1000mL，混匀。
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3.3.4氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：吸取氢氧化钠溶液（3.3.3)10mL.加水溶解至100mL。3.3.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠，溶解于1000mL水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。
3.3.6乙醇溶液（25%）：量取200mL无水乙醇与800mL水混勺。3.3.7硫酸溶液（1mol/L）：于2000mL烧杯中先注人700mL水，吸取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒人水中，用水稀释到1000mL。
3.4培养基
3.4.1乳酸杆菌琼脂培养基：可按A.1配制。3.4.2乳酸杆菌肉汤培养基：可按A.2配制。3.4.3烟酸测定用培养基：可按A.3配制注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制3.5标准品
烟酸（C.H，NO）：纯度≥99.5%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.6标准溶液配制
3.6.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0mg烟酸标准品，用乙醇溶液溶解并移至500mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100μg烟酸，3.6.2烟酸标准中间液（1g/mL）：准确吸取1.0mL烟酸标准储备液（3.6.1）置于100mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于1ug烟酸3.6.3烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00mL烟酸标准中间液（3.6.2）置于50mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100ng烟酸。4仪器和设备
天平：感量分别为0.01g和0.1mg。4.1
均质设备：用于试样的均质化
恒温培养箱：36℃土1℃。
涡旋振荡器。
压力蒸汽消毒器：121℃（0.10MPa~0.12MPa）。离心机：转速≥2000r/min。
pH计：精度士0.01。
分光光度计。
超净工作台。
超声波振荡器。
注：玻璃仪器使用前.用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后烘干，于170℃干热3h后使用。5分析步骤
5.1储备菌种的制备
GB5009.89—2016
将菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum（ATCC8014)转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃士1℃恒温培养箱中培养20h～24h，取出后放人2℃～4℃冰箱中保存。每月至少传种一次，作为储备菌株保存
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃士1℃恒温培养箱中培养20h24h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代～3代以保证菌株活力。
5.2接种液的制备
试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基中，于36℃士1℃恒温培养箱中培养6h18h。在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。加人10mL已灭菌的生理盐水重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，去上清液。重复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水，使其充分混合均匀制成混悬液，备用。用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9%生理盐水为参比，读取该菌悬液的透光值，用0.9%生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60%～80%之间。立即使用。
5.3试样制备
谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm～0.5mm）；乳粉、米粉等试样混匀；肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需勾浆混匀；液体试样用前振摇混合。如不能马上检测，于4℃冰箱保存。5.4试样提取
准确称取约烟酸试样，一般乳类、新鲜果蔬试样2g～5g（精确至0.01g）：谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2g~1g（精确至0.01g），液态试样5g；乳粉、米粉等准确称取适量试样2g（精确至0.01g）；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g；食品0.2g1g；液体饮料或流质、半流质试样5g～10g于100mL锥形瓶中，加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液。在121℃下，水解30min后冷却至室温。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0~6.5.再用0.1mol/L盐酸调pH至4.5±0.1，用水定容至100mL，用无灰滤纸过滤，滤液备用。5.5稀释
根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释（f），使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0ng～500.0ng范围内
5.6测定系列管制备
5.6.1标准系列管
取试管分别加人烟酸标准工作液0.00mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL和5.00mL，补水至5.0mL，相当于标准系列管中烟酸含量为0.0ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400ng、500ng。加5.0mL烟酸测定用培养基，见表1。混匀。每个标准点应制备3管。
GB5009.89—2016
表1标准曲线管的制作
试管号（No.）
蒸馏水/mL
标准溶液*/ml
培养基/mL
*试管No.1~2中不添加标准溶液；2中滴加菌液；No.3~10中添加标准品溶液的浓度依次增高。3个重复。5.6.2试样系列管
取4支试管，分别加人1.0mL、2.0mL，3.0mL、4.0mL试样提取液，补水至5.0mL，加人5.0mL烟酸测定用培养液，见表2。混匀，每个浓度做3个重复表2试样管的制作
试管号（No.）
蒸馏水/mL
样品/mL
培养基/mL
5.6.3灭菌
将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞，于121℃（0.10MPa～0.12MPa)高压灭菌5min。灭菌完成后，迅速冷却，备用。5.7培养
5.7.1接种：在无菌操作条件下，将接种液转入无菌滴管，向每支测定管接种一滴。5.7.2培养：将加完菌液的试管置于36℃土1℃恒温培养箱中培养16h～24h，直至获得最大浊度，即再培养2h浊度无明显变化。另准备一支标准0管（含0.0ng烟酸）不接种作为0对照管。5.8测定
用厚度为1cm比色杯，在波长550nm条件下读取光密度值，将培养好的测定管用涡旋混器混匀。以未接种0对照管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。取出最高浓度标准曲线管振荡5s，测定光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。5.9标准曲线的制作
以标准系列管烟酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，也可对各个标准点做拟合曲线。各个标准点3管之间的光密度值的相对标准偏差应小于10%，如果某一标准点3支试样管中有2支烟酸含量落在50ng～500ng范围内，且该两管之间折合为每毫升试样提取液中烟酸含量的偏差小于10%，则该结果可用，如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%，则该点舍去，不参与标准曲线的绘制。
6分析结果的表述
GB 5009.89—2016
试样结果计算：从标准曲线查得试样系列管中烟酸的相应含量（c），按式（1)进行结果计算。测定液浓度按式(1)计算：
pxvixf
式中：
试样中烟酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；..1)
试样系列管折合为试样提取液中烟酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；试样提取液稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）；
折算成每百克试样中烟酸毫克数的换算系数。结果保留两位有效数字。
7精密度
普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%：强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。8其他
按样品种类将待测试样稀释到线性范围内再对样品进行测试本标准试管法线性范围50ng/mL～500ng/mL；天然类等含量较低的食品试样称样量为5g时，检出限为0.05mg/100g，定量限为0.1mg/100g；强化食品等含量较高的食品试样称样量为1g时，检出限为0.25mg/100g，定量限为0.5mg/100g。第二法
高效液相色谱法
9原理
高蛋白样品经沉淀蛋白质，高淀粉样品经淀粉酶酶解，在弱酸性环境下超声波振荡提取，以C1：色谱柱分离，在紫外检测器检测261nm波长处检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，计算试样中烟酸和烟酰胺含量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水10.1
10.1.1盐酸（HCI)：优级纯。
氢氧化钠（NaOH)：优级纯。
高氯酸（HCIO）：体积分数为60%优级纯10.1.37
甲醇（CHOH）：色谱纯。
异丙醇(CHO)：色谱纯。
庚烷磺酸钠（C,HisNaO,S)：色谱纯。淀粉酶：酶活力≥1.5p/mg
10.2试剂配制
GB5009.89—2016
盐酸（5.0mol/L）：用量筒量取415mL盐酸，于1000mL烧杯中，加585mL水，混匀盐酸（0.1mol/L）：用移液管吸取8.3mL盐酸，于1000mL烧杯中，加991.7mL水，混匀。氢氧化钠（5.0mol/L）：称取200g氢氧化钠（3.2.2）于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。
10.2.4氢氧化钠（0.1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠（3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。
10.2.5流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经0.45μm膜过滤。10.3烟酸和烟酰胺标准溶液
烟酸（CH,NOz）和烟酰胺（C,H,NzO)：纯度>99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
烟酸和烟酰胺标准储备液（1.000mg/mL）：准确称取烟酸及烟酰胺标准品各0.05g（精确到0.1mg），分别置于100mL容量瓶中，用0.1mo1/L盐酸溶解，定容至刻度.混匀（4℃冰箱中可保存1个月）。
注：标准储备液配制完以后，需要进行浓度校正，校正方法见附录B。10.3.2烟酸和烟酰胺标准混合中间液（100.0μg/mL）：准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液（10.3.1)各10.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。临用前配制。10.3.3烟酸和烟酰胺标准混合工作液：分别准确吸取标准混合中间液（10.3.2）1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，得到浓度分别为1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL，10.0μg/mL、20.0μg/mL的标准混合工作液。临用前配制11
仪器和设备
天平：感量0.1mg。
恒箱培养箱：30℃~80℃。
超声波振荡器。
11.4pH计：精度土0.01。
11.5高效液相色谱仪：带紫外检测器11.6
一次性微孔滤头：带0.45um微孔滤膜分析步骤
12.1试样制备与处理
非粉状固态试样粉碎并混合均勾；液态试样摇匀。6
GB5009.89—2016
12.1.1淀粉类和含淀粉的食品（即食谷物、面包、饼干、面条、小麦粉和杂粮粉等制品）称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），加人约25mL45℃～50℃的水，称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g）于150mL锥形瓶中，加人约0.5g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞.置于50℃～60℃的培养箱内培养约30min，取出冷却至室温。注：如果条件允许，建议酶解时采用55℃土5℃水浴振摇。12.1.2不含淀粉的食品（调制乳、调制乳粉、饮料类、固体饮料类、豆粉和豆浆粉等制品）称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），加人约25mL45℃～50℃的水，称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g）于150mL锥形瓶中.置于超声波振荡器中振荡约10min以上充分溶解，静置5min10min，并冷却至室温。12.1.3提取
待试样溶液降至室温后，用5.0mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节试样溶液的pH至1.7士0.1,放置约2min后，再用5.0mol/L氢氧化钠溶液和0.1mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的pH至4.5土0.1,置于50℃水浴超声波振荡器中振荡10min以上充分提取，冷却至室温后转至100mL容量瓶中.用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于100mL容量瓶中.用水定容至刻度后混匀，经滤纸过滤。滤液再经0.45um微孔滤膜加压过滤，用样品瓶收集，即为试样测定液。注：必要时，试样测定液用水进行适当的稀释（），使试样测定液中烟酸和烟酰胺浓度在1ug/mL20μg/mL范围内。
12.2参考液相色谱条件
参考液相色谱条件列出如下：
色谱柱：Cis（粒径5um，250mmX4.6mm）或具有同等性能的色谱柱：a）
柱温：25℃±0.5℃；
紫外检测器：检测波长为261nm；d)
流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤；流速：1.0mL/min；
f）进样量：10μL或20μL。
12.3测定
12.3.1标准曲线测定
按照已经确立的色谱条件，将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液依次按上述推荐色谱条件进行测定（标准样品色谱图见C.1）。记录各组分的色谱峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。12.3.2试样溶液的测定
将试样测定液按上述推荐色谱条件进样测定。记录各组分色谱峰面积或峰高，根据标准曲线计算出试样测定液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度β。7
分析结果的表述
试样烟酸和烟酰胺含量计算
试样中烟酸或烟酰胺的含量，按式（2)计算：p.xVx100
Xi或2=
式中：
X1成2
试样中烟酸或烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V
试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；试样的质量，单位为克（g）。
注：液态试样中烟酸或烟酰胺含量也可以微克每百毫升（μg/100mL）为单位。13.2
试样中维生素PP的总含量
试样中维生素PP的总含量X.按式(3)计算：X=X+X,X1.008
式中：
试样中维生素PP的总含量，单位为微克每百克（μg/100g）；—试样中烟酸的含量，单位为微克每百克（μg/100g)；试样中烟酰胺的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；烟酰胺转化成烟酸的系数。
结果表述
结果保留到整数。
精密度
GB5009.89—2016
..（2)
··（3)
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
当称样量为5g时，烟酸检出限为30uμg/100g，定量限为100μg/100g，烟酰胺检出限为40μg/100g定量限为120μg/100g。8
乳酸杆菌琼脂培养基
光解陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
聚山梨糖单油酸酯
番茄汁
蒸馏水
附录A
培养基和试剂
1000mL
GB5009.89—2016
先将除琼脂以外的其他成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.8士0.2（20℃～25℃），再加人琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。混合均匀后分装试管，每管10mL。121℃高压灭菌15min，备用。A.2
乳酸杆菌肉汤培养基
光解陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
聚山梨糖单油酸酯
番茄汁
蒸馏水
1000mL
将上述成分溶解于水中，调节pH6.8士0.2（20℃～25℃），分装10mL于试管中121℃高压灭菌15min.备用。
烟酸测定用培养基
1成分
酪蛋白氨基酸
葡萄糖
乙酸钠
L-胱氨酸
DL-色氨酸
盐酸腺嘌呤
盐酸鸟嘌呤
尿嘧啶
盐酸硫胺素
泛酸钙
盐酸吡哆醇
核黄素
P-氨基苯甲酸
生物素
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
硫酸镁
氯化钠
硫酸亚铁
硫酸锰
蒸馏水
注：自行配制烟酸测定培养基时.所有试剂不得含有烟酸。制法
200μg
200μgbzxz.net
400μg
400μg
100μg
1000mL
将上述成分溶解于水中.调pH至6.7土0.2（20℃～25℃），备用GB 5009.89—2016
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