GB 5009.118-2016 食品安全国家标准 食品中T-2毒素的测定 GB5009.118-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5009.118—2016
食品安全国家标准
食品中T-2毒素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.118—2016
本标准代替GB/T5009.118—2008《谷物中T-2毒素的测定》、GB/T23501—2009《食品中T-2毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T1771-2006《进出口粮谷中T-2毒素的测定免疫亲和柱-液相色谱法》SN/T2676—2010《进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法》。bzxZ.net
本标准与GB/T5009.118—2008相比，主要变化如下：—一标准名称修改为“食品安全国家标准食品中T-2毒素的测定”；一增加了适用范围；
——增加了直接ELISA法二。
1范围
食品安全国家标准
食品中T-2毒素的测定
本标准规定了食品中T-2毒素的测定方法GB5009.118—2016
本标准第一法适用于粮食及粮食制品，酒类，酱油、醋、酱及酱制品中T-2毒素含量的测定，第二法、第三法适用于粮食及粮食制品中T-2毒素的测定。第一法免疫亲和层析净化液相色谱法2原理
用提取液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化、衍生后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
3.1.1甲醇（CH,OH)：色谱纯。
3.1.2乙腈（CH,CN)：色谱纯。
3.1.3甲苯（C,H,CH,）：色谱纯3.1.44-二甲基氨基吡啶。
3.1.51-葱睛（1-anthroylnitrile,1-AN)。3.2试剂配制
提取液：甲醇-水（8：2.体积比）。3.2.13
3.2.24-二甲基氨基吡啶溶液：准确称取0.0325g4-二甲基氨基吡啶于100mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。
3.2.31-葱睛溶液：准确称取0.030g1-葱于100mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。3.3标准品
T-2毒素（C2H3O。.CAS号：21259-20-1)：纯度≥98.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备液：准确称取适量的T-2毒素标准品（精确至0.0001g），用乙睛溶解，配制成浓度为1
100μg/mL的标准储备液，-18℃以下避光保存GB 5009.118—2016
3.4.2标准工作液：根据需要准确吸取适量的标准储备液，用乙睛稀释，配制成5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL200ng/mL的标准工作液，4C避光保存。3.5材料
3.5.1T-2毒素免疫亲和柱：柱规格1mL或3mL,柱容量≥1500ng，或等效柱3.5.2玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm，无荧光特性。4仪器和设备
高效液相色谱仪：配有荧光检测器。4.1
高速粉碎机：转速>12000r/min。均质器：转速≥12000r/min。
氮吹仪。
离心机。
涡旋混合仪。
空气压力泵。
试验筛：孔径1.0mm。
天平：感量0.0001g和0.01g。
超声波发生器：功率>180W。
玻璃注射器：10mL。
5分析步骤
5.1提取
5.1.1粮食及粮食制品
将样品研磨，硬质的粮食等用高速粉碎机磨细并通过试验筛。称取25.0g（精确到0.1g）过筛样品于容量瓶中，用提取液定容至100mL，转移至均质杯中，以均质器高速搅拌提取2min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加人40mL水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.2酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g（精确到0.1g）混匀的试样，用甲醇定容至50.0mL，超声提取10min，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加人40mL水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.1.3酒类
取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g（精确到0.1g）于50mL容量瓶中.用甲醇定容至刻度，摇匀，定量滤纸过滤。移取10.0mL滤液加入40mL水稀释，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。5.2净化和洗脱
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0mL5.1中的提取滤液，注人玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至空气进2
GB5009.118—2016
人亲和柱中。用10mL水淋洗亲和柱，流速为1滴/s2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集洗脱液。5.3衍生
5.3.1标准工作液的衍生：取不同浓度的标准工作液各1mL，在50℃下用氮气吹于，加人50L4-二甲基氨基吡啶溶液和50ul1-葱腈溶液，在涡旋混合器上混匀1min，50℃反应15min，在冰水中冷却10min后取出，50℃下氮气吹干，用1.0mL流动相溶解，待HPLC测定。5.3.2样品的衍生：将5.2中洗脱液在50℃下用氮气吹干，按5.3.1步骤进行。5.4测定
5.4.1高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下：a
色谱柱：Cs柱，柱长150mm，内径4.6mm.粒径5um，或等效柱：b）流动相：乙睛-水（75：25.体积比）；c）
流速：1.0mL/min；
检测波长：激发波长381nm.发射波长470nm；d)
进样量：20μL；
柱温：35℃。
5.4.2色谱测定
在5.4.1色谱条件下，将系列T-2毒素标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪。待仪器稳定后以自标物质的浓度为横坐标（轴），目标物质的峰面积为纵坐标（V轴），对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式（1)计算：y=ax+b
式中：
y--目标物质的峰面积比；
回归曲线的斜率；
目标物质的浓度；
b——回归曲线的截距。
·（1)
标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样品含量超过标准曲线范围，需稀释后再测定。
5空白试验
不称取试样，按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。5.6结果计算
试样中T-2毒素的含量按式(2)计算：X=P×VX1000
mX1000
式中：
试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样测定液中T-2毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；衍生化后的定容体积，单位为毫升（mL)；2)
单位换算常数；
试样的称样量，单位为克（g)；一稀释倍数。
注：计算结果需扣除空白值，保留两位有效数字。精密度
GB 5009.118—2016
样品中T-2毒素的含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7其他
本方法对粮食及粮食制品中T-2毒素的检出限为10ug/kg，定量限为33ug/kg；对酒类，酱油、醋、酱及酱制品中T-2毒素的检出限为5ug/kg，定量限为17ug/kg第二法
8原理
间接ELISA法
将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测试样（含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加人酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。
试剂和原料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。9.1试剂
甲醇（CH:OH)。
石油醚（C,H，BrMg）。
三氯甲烷（CHCI）。
无水乙醇（C,HOH）。
乙酸乙酯（CHO）。
二甲基甲酰胺(C,H,NO)。
四甲基联苯胺（TMB)。
吐温-20（CssH1+O2）。
30%过氧化氢（30%H,0。）。
碳酸钠（NazCO）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
磷酸二氢钾（KH2PO.)。
3磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O)。9.1.14
氯化钠(NaCI)。
氯化钾（KCI）。
柠檬酸(C.H.O,·H2O)。
9.1.17抗体：杂交瘤细胞系产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。9.1.18
抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白（BSA)的结合物兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物（酶标二抗）。9.2i
试剂配制
ELISA缓冲液系统
GB5009.118—2016
9.2.1.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠、2.93g碳酸氢钠，加水稀释至1000mL。
9.2.1.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称PBS-T）。配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钟、2.9g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.5mL叶温-20.加水至1000mL9.2.1.3底物缓冲液为pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：0.1mo1/L柠檬酸，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液；0.2mol/L磷酸氢二钠，即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液：取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即可9.2.1.4底物溶液：取50μLTMB溶液（10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中），加10mL底物缓冲液及10L30%过氧化氢，混匀。
9.3标准品
T-2毒素（C24Ha4O。.CAS号：21259-20-1），纯度≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
9.4标准溶液配制
9.4.1标准储备液：准确称取适量标准品（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液，一18℃以下避光保存9.4.2标准工作液：根据需要用20%甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可）将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液。9.5材料
9.5.1酶标板（48孔或96孔）。
9.5.2具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。9.5.3层析柱：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲紧10
仪器和设备
注：所有玻璃器Ⅲ均用硫酸洗液浸泡，用水冲洗。10.1酶标仪。
10.2电动振荡器。
10.3电热恒温水浴锅
10.4天平：感量为0.0001g和0.01g。5
11分析步骤
11.1提取
GB5009.118—2016
称取20.0g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4：1，体积比），密塞，振荡1h，滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发Ⅲ中，置90℃C水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗人250mL分液漏斗中再用20mL甲醇-水（4：1）分次洗涤，转人同一分液漏斗中，振荡1.5min，静置约15min，收集下层甲醇-水提取液过层析柱净化将过柱后的洗脱液倒人蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至于，热加3mL乙酸乙酯·加热至沸：挥干，再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转人浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发血，并入浓缩瓶中，将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测。11.2检测
11.2.1用T-2-BSA（4μg/mL)包被酶标板，每孔100uL，4℃过夜11.2.2酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加人不同浓度的标准工作液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样中的毒素含量）与抗体溶液的混合液（1：1.体积比，每孔100μL，该混合液应于使用前的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃1h。11.2.3酶标板洗3次，每次3min后，加人酶标二抗，每孔100uL，37℃1.5h。同上述洗涤后，加人底物溶液，每孔100μL，37℃30min11.2.4
用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值分析结果的表述
试样中T-2毒素的含量，按式（3）计算：Vi
式中：
试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；++
酶标板上所测得的T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克（ng)；试样提取液的体积，单位为毫升（mL)；滴加样液的体积，单位为毫升（mL）；样液的总稀释倍数；
试样的称样量，单位为克（g）。注：测定结果保留小数点后一位有效数字。13精密度
......(3)
样品中T-2毒素的含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
14其他
方法检出限为1ug/kg，定量限为3μg/kg。6
原理及依据
第三法直接ELISA法
GB5009.118—2016
15.1直接ELISA法一：将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗原，加人一定量的酶标记抗体与试样（含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量15.2直接ELISA法二：样品中的T-2毒素与T-2毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的T-2毒素与T-2毒素酶标记物，然后加入反应底物.用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中的T-2毒素含量。16
试剂和原料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水16.1试剂
甲醇(CH,OH)。
石油醚（C,H,BrMg）。
三氯甲烷（CHCI）。
无水乙醇（C,H，OH)。
乙酸乙酯（CH.O,）。
二甲基甲酰胺(C,H,NO)。
四甲基联苯胺（TMB)。
吐温-20（C58Hi14O26）。
30%过氧化氢（30%H2O2）。
抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA）16.2试剂配制
16.2.1ELISA缓冲液系统
16.2.1.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59g碳酸钠（NazCO.）、2.93g碳酸氢钠（NaHCO），加水稀释至1000mL。16.2.1.2洗液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称PBS-T）。配制方法为：称取0.2g磷酸二氢钾、2.9g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.5mL吐温-20，加水至1000mL。16.2.1.3样品稀释液：pH7.2的磷酸盐缓冲液（简称PBS）。配制方法为：分别称取0.55g磷酸二氢钠(NaH,PO·H,O）2.85g磷酸氢二钠（Na2HPO·2H,O)和9g氯化钠.用水溶解并定容至1L。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（>1：7），应向此缓冲液中加人10%的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为10%。
16.3标准品
I-2毒素（C2H0g，CAS号：21259-20-1），纯度98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
16.4标准溶液配制
GB5009.118—2016
16.4.1标准储备液：准确称取适量标准品（精确至0.0001g）.用乙睛溶解，配制成浓度为200μg/mL的标准储备液，一18℃以下保存16.4.2标准工作液：根据需要，用含20%甲醇的PBS或样品稀释液将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液。
16.5材料
16.5.1T-2毒素检测试剂盒：包括包被有抗体的微孔条、T-2毒素标准液、T-2毒素酶标记物、T-2毒素抗体、底物、样品稀释液、反应停止液。16.5.2酶标板（48孔或96孔）。16.5.3具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶16.5.4层析柱：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面.再加人0.4g活性炭，敲紧。17
仪器和设备
注：所有玻璃器血均用硫酸洗液浸泡，用水冲洗17.1酶标检测仪
17.2酶标板（48孔或96孔）。
17.3电动振荡器
17.4电热恒温水浴锅。
17.5天平：感量0.0001g，0.01g。17.6均质器。
17.7粉碎机。
分析步骤
18.1提取
18.1.1直接ELISA法
称取20g粉碎并通过20目筛的试样，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇（4：1.体积比），密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发血中.置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水（4：1，体积比）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振荡1.5min，静置约15min，收集下层甲醇-水提取液过层析柱净化
将过柱后的洗脱液倒人蒸发Ⅲ中，并于水浴锅上浓缩至干，热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次.最后加3mL乙酸乙酯冷至室温后转人浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发血，并入浓缩瓶中，将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测18.1.2直接ELISA法二
将样品按四分法缩分至1kg，全部磨碎至颗粒可通过20目筛大小，混匀，均分成两份作为试样，分8
GB5009.118—2016
别装入清洁的容器内，密封。称取25.0g试样（精确到0.1g），加人125mL甲醇-水（7：3，体积比），均质1min2min.5000r/min离心10min。离心后取50μL滤液加人300μL样品稀释液，混匀。取50L进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为35。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。18.2检测
18.2.1直接ELISA法一
18.2.1.1用T-2-BSA（4μg/mL）包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。18.2.1.2酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的标准工作液（制作标准曲线）或试样提取液（检测试样中的毒素含量）与抗体-酶结合物溶液（1：100，体积比）的混合液（1：1，体积比，每孔100L，该混合液应于使用前的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃1.5h18.2.1.3酶标板洗3次，每次3min后，加人底物溶液。每孔100μL，37℃30min。18.2.1.4用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。18.2.2直接ELISA法二
18.2.2.1将测定需用的微孔条插入微孔架，记录标准液和样液在微孔架上的位置。吸取50μLT-2毒素标准液（浓度为0ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL）和样液至各微孔。
18.2.2.2吸取50LT-2毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加入50LT-2毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于22℃～25℃避光孵育1h18.2.2.3倒出孔中液体，以250μL蒸馏水反复清洗微孔，重复操作3次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。18.2.2.4迅速加入100μL底物至各微孔，于22℃～25℃避光孵育30min。18.2.2.5孵育完毕后加人100μL反应停止液至各微孔，充分混匀，上酶标仪测量并记录每个微孔试液450nm波长处的吸光度值（加入反应终止液后应在30min内读取吸光度）。19分析结果的表述
19.1直接ELISA法一
试样中T-2毒素的含量按式（4）计算：V
式中：
试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；酶标板上所测得的T-2毒素的量，根据标准曲线求得，单位为纳克（ng）；试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；滴加样液的体积，单位为毫升（mL）；样液的总稀释倍数；
试样的称样量，单位为克（g）。注：测定结果保留小数点后一位有效数字。19.2直接ELISA法二
试样中T-2毒素的含量按式（5)计算：（4)
式中：
x=pxvx1000
mx1000
试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（ug/kg)；GB5009.118—2016
...（5
-从标准工作曲线上得到的样品中T-2毒素含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；1000
单位换算常数；
样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。注；测定结果保留小数点后一位有效数字。精密度
样品中T-2毒素的含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
直接ELISA法一的检出限为1μg/kg，定量限为3μg/kg。直接ELISA法二的检出限为3.5μg/kg定量限为11ug/kg。
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