GB 5009.128-2016
基本信息
标准号： GB 5009.128-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
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标准简介
GB 5009.128-2016 食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定
GB5009.128-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.128—2016
食品安全国家标准
食品中胆固醇的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.128—2016
本标准代替GB/T5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》、GB/T22220—2008《食品中胆固醇的高效液相色谱法》和GB/T9695.24一2008《肉与肉制品胆固醇含量测定》。
本标准与GB/T5009.128—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中胆固醇的测定”；一增加了气相色谱法作为第一法，高效液相色谱法作为第二法；比色法改为第三法；修改了GB/T9695.24一2008气相色谱法的前处理方法中提取溶剂、无水乙醇的添加量和定容体积。
1范围
食品安全国家标准
食品中胆固醇的测定
本标准规定了食品中胆固醇的测定方法GB5009.128—2016
本标准适用干食品中胆固醇的测定，第一法气相色谱法适用干肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品等各类动物性食品以及植物油脂中胆固醇的测定；第二法高效液相色谱法适用于肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品等各类动物性食品中胆固醇的测定；第三法比色法适用于肉及肉制品、蛋及蛋制品等动物性食品中胆固醇的测定。
云气相色谱法
第一法
2原理
样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，石油醚和无水乙醚混合提取，提取液浓缩至干，无水乙醇溶解定容后，采用气相色谱法检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯.水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1甲醇(CH.OH)：色谱纯。
3.1.2无水乙醇（C,HsOH）。
3.1.3石油醚：沸程30℃~60℃。3.1.4无水乙醚（C,HO)。
3.1.5无水硫酸钠（Na,SO,）。
3.1.6氢氧化钾(KOH)。
3.2试剂配制
60%氢氧化钾溶液：称取60g氢氧化钾，缓慢加水溶解，并定容至100mL。石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）：将石油醚和无水乙醚等体积混合均匀。3标准品
胆固醇标准品（C2.H46O.CAS号：57-88-5）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制
3.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）称取胆固醇标准品0.05g（精确至0.1mg），用无水乙醇溶解并定容至50mL，放置0℃～4℃密封1
可贮藏半年
3.4.2胆固醇标准系列工作液
GB5009.128—2016
分别吸取标准储备液（1.0mg/mL）25L、50μL、100μL、500μL、2000μL，用无水乙醇定容至10mL，该标准系列工作液的浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL。现用现配。4仪器和设备
4.1气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。电子天平：感量为1mg和0.1mg。4.2
匀浆机。
皂化装置。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1肉及肉制品等各类固体试样取样品的可食部分200g进行均质。将试样装入密封的容器单，防正变质和成分变化。试样应在均质化24h内尽快分析。
5.1.2植物油脂、乳品等液体试样取混匀后的均匀液体试样装人密封容器单待测。5.2样品处理
5.2.1皂化
称取制备后的样品0.25g~10g（准确至0.001g，胆固醇含量约为0.5mg~5mg），于250mL圆底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，10mL60%氢氧化钾溶液，混匀。将试样在100℃磁力搅拌加热电热套皂化回流1h，不时振荡防止试样黏附在瓶壁上，皂化结束后，用5mL无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下圆底烧瓶，用流水冷却至室温。5.2.2提取
定量转移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次冲洗圆底烧瓶.洗液并人分液漏斗，再用40mL石油醚-无水乙醚混合液（1+十1.体积比）分2次～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，振摇2min，静置，分层。转移水相，合并三次有机相，用水每次100mL洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠脱水转移到150mL平底烧瓶中。5.2.3浓缩
将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解并定容至5mL，待气相色谱仪测定
不同试样的前处理需要同时做空白试验2
5.3测定
5.3.1仪器参考条件
GB5009.128—2016
色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱，柱长30m，内径0.32mm，粒径0.25um，或同等性能的色谱柱；
载气：高纯氮气，纯度≥99.999%：恒流2.4mL/min；b）
柱温（程序升温）：初始温度为200℃，保持1min，以30℃/min速率升至280℃，保持10min；进样口温度280℃；
检测器温度：290℃；
进样量：1μL；
进样方式：不分流进样，进样1min后开阀；空气流量：350mL/min；www.bzxz.net
氢气流量：30mL/min。
5.3.2标准曲线的制作
分别取胆固醇标准系列工作液注入气相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作标准曲线5.3.3测定
试样溶液注人气相色谱仪，测定峰面积，由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。根据保留时间定性，外标法定量。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.1。分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（1)计算：pxv
mx1000
式中：
试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样溶液中胆固醇的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；试样溶液最终定容的体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g）；
1000、100换算系数。
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
当称样量为0.5g，定容体积为5.0mL，方法的检出限为0.3mg/100g，定量限为1.0mg/100g。3
9原理
高效液相色谱法
第二法
GB5009.128—2016
样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，石油醚和无水乙醚混合提取，提取液浓缩至干，无水乙醇溶解定容后，采用高效液相色谱仪检测，外标法定量试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
甲醇（CH,OH)：色谱纯。
无水乙醇（C,H.OH)。
石油醚：沸程30℃～60℃。
无水乙醚（C,HO）。
无水硫酸钠（Na2SO,）。
氢氧化钾(KOH)。
试剂配制
60%氢氧化钾溶液：称取60g氢氧化钾，缓慢加水溶解，并定容至100mL。10.2.1
石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）：将石油醚和无水乙醚等体积混合均勾10.3标准品
胆固醇标准品（C27H4O.CAS号：57-88-5）：纯度≥99%。10.4标准溶液配制
10.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）：称取胆固醇标准品0.05g（精确至0.1mg），用无水乙醇溶解并定容至50mL，放置0℃～4℃密封可贮藏半年。2胆固醇标准系列工作液：分别吸取标准储备液（1.0mg/mL）25uL、50μuL、100μL、500μL、10.4.2
2000uL，用无水乙醇定容至10mL，该标准系列工作液的浓度分别为2.5μg/mL、5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL、200μg/mL。现用现配。11
仪器和设备
匀浆机。
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或相当的检测器电子天平：感量为1mg和0.1mg。11.3
2分析步骤
12.1试样制备
肉及肉制品等各类固体试样
GB5009.128—2016
样品取可食部分200g，使用绞肉机或匀浆机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化24h内尽快分析2乳品等液体试样
取混匀后的均匀液体试样装入密封容器里待测。12.2样品处理
12.2.1皂化
称取制备后的样品0.25g~10g（精确至0.001g，胆固醇含量约为0.5mg~5mg），于250mL圆底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，10mL60%氢氧化钾溶液，混匀。将试样在100℃磁力搅拌加热电热套皂化回流1h，不时振荡防正试样黏附在瓶壁上，皂化结束后，用5mL无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下圆底烧瓶，用流水冷却至室温。12.2.2提取
定量转移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次冲洗圆底烧瓶，洗液并人分液漏斗，再用40mL石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）分2次～3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗，振摇2min，静置.分层。转移水相，合并三次有机相，用水每次100mL洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇.防正乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠脱水转移到150mL平底烧瓶中。12.2.3浓缩
将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解并定容至5mL.溶液通过0.45um过滤膜，收集滤液于进样瓶中，待高效液相色谱仪测定不同试样的前处理需要同时做空白试验。12.3测定
仪器参考条件
色谱柱：C反相色谱柱，柱长4.6mm，内径150mm，粒径5um，或同等性能的色谱柱；b）柱温：38℃；
流动相：甲醇；
流速：1.0mL/min；
测定波长：205nm；
进样量：10μL。
标准曲线的制作
分别取10L胆固醇标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作标准曲线5
12.3.3测定
GB5009.128—2016
将10uL试样溶液注人高效液相色谱仪，测定峰面积，由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.2。13
分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（2)计算：pxv
mX1000
式中：
试样中胆固醇的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样溶液中胆固醇的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；试样溶液定容体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g)；
换算系数
1000、100
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5其他
.（2)
当称样量为1g，定容体积为5mL，方法的检出限为0.64mg/100g，定量限为2.1mg/100g。第三法比色法
16原理
样品进行脂肪提取后的油脂，经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，用石油醚提取，浓缩后加入冰乙酸以硫酸铁铵试剂作为显色剂，采用分光光度计，在560nm～575nm波长下检测，外标法定量。17
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水17.1试剂
无水乙醇(C,H,OH)。
石油醚：沸程30℃~60℃。
硫酸（H,SO)。
冰乙酸（CH,O2）：优级纯。
磷酸(H,PO,)。
硫酸铁铵[FeNH,（SO,)，·H,O]钢瓶氮气（N2）：纯度99.99%。海砂。
氢氧化钾（KOH)。
氢氧化钠(NaOH)。
盐酸（HCI)。
乙醚(C,H,O)。
17.2试剂配制
GB5009.128—2016
铁矾储备液：称取4.463g硫酸铁铵[FeNH（SO,）2·H,O]于100mL磷酸中（如果不能充分溶解，超声后取上清液），贮藏于干燥器内，此液在室温中稳定。17.2.2
铁矾显色液：吸取铁矾储备液10mL用硫酸定容至100mL。贮藏于干燥器内，以防吸水。50%氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用水溶解，并定容至100mL。17.2.3
5%氯化钠溶液：称取5g氯化钠用水溶解，并定容至100mL。17.2.5
盐酸溶液(1十1)：将盐酸与水等体积混合均匀。氢氧化钠溶液（240g/L）：称取24g氢氧化钠，用水溶解并定容至100mL17.2.7海砂：取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用盐酸溶液（1+1）煮沸0.5h，用水洗至中性再用氢氧化钠溶液（240g/L）煮沸0.5h.用水洗至中性，经100℃土5℃干燥备用。17.3标准品
胆固醇标准品（C2.HOCAS号：57-88-5）：纯度≥99%。17.4标准溶液配制
17.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）：称取胆固醇标准品0.10g（精确至0.1mg），用冰乙酸溶解并定容至100mL。放置4℃密封可贮藏半年。17.4.2胆固醇标准工作液（100μg/mL）：吸取胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）10mL，用冰乙酸定容至100mL。现用现配。
仪器和设备
18.1匀浆机。
分光光度计
18.3电子天平：感量为1mg和0.1mg。19
分析步骤
胆固醇标准曲线的制作
吸取胆固醇标准工作液0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL分别置于10mL试管中，在各管内加人冰乙酸使总体积均达4mL。沿管壁加人2mL铁矾显色液，混匀，在15min～90min内，在560nm575nm波长下比色。以胆固醇标准浓度为横座标，吸光度为纵坐标制作标准曲线19.2测定
食品中脂肪的提取与测定
根据食品种类分别用索氏脂肪提取法，研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。并计算出每100g食品中的脂肪含量。
2食品中胆固醇的测定
GB 5009.128—2016
将提取的油脂3滴～4滴（约含胆固醇300μg～500μg），置于25mL试管中，准确记录其质量。加人4mL无水乙醇，0.5mL50%氢氧化钟溶液.混匀，装上冷凝管，在65℃恒温水浴锅中皂化1h。皂化时每隔20min～30min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，用流水冷却。加入3mL5%氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻璃塞，在电动振荡器上振摇2min，静置分层（一般约需1h以上）。取上层石油醚液2mL.置于10mL具塞玻璃试管内，在65℃水浴中用氮气吹干.加入4mL冰乙酸，2mL铁矾显色液，混匀放置15min后在560nm～575nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。
不同试样的前处理需要同时做空白试验。20
分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（3)计算：AxcxVi
,Xmx1000
式中：
试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；测得的吸光度值在胆固醇标准曲线上的胆固醇含量，单位为微克（ug）；试样中脂肪含量，单位为克每百克（g/100g）；石油醚总体积，单位为毫升（mL）；取出的石油醚体积，单位为毫升（mL）；称取食品油脂试样量，单位为克（g）；换算系数。
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。21
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。22其他
方法的检出限为2.4mg/100g，定量限为7.2mg/100g。（3）
附录A
胆固醇标准的色谱图
胆固醇标准溶液的气相色谱图见图A.1。PM3
450寸
250号
200元
150号
胆固醇标准溶液的气相色谱图
A.2胆固醇标准溶液的高效液相色谱图见图A.2。0.14
胆固醇标准溶液的高效液相色谱图10
GB5009.128—2016
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GB5009.128—2016
食品安全国家标准
食品中胆固醇的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局
GB5009.128—2016
本标准代替GB/T5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》、GB/T22220—2008《食品中胆固醇的高效液相色谱法》和GB/T9695.24一2008《肉与肉制品胆固醇含量测定》。
本标准与GB/T5009.128—2003相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中胆固醇的测定”；一增加了气相色谱法作为第一法，高效液相色谱法作为第二法；比色法改为第三法；修改了GB/T9695.24一2008气相色谱法的前处理方法中提取溶剂、无水乙醇的添加量和定容体积。
1范围
食品安全国家标准
食品中胆固醇的测定
本标准规定了食品中胆固醇的测定方法GB5009.128—2016
本标准适用干食品中胆固醇的测定，第一法气相色谱法适用干肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品等各类动物性食品以及植物油脂中胆固醇的测定；第二法高效液相色谱法适用于肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品等各类动物性食品中胆固醇的测定；第三法比色法适用于肉及肉制品、蛋及蛋制品等动物性食品中胆固醇的测定。
云气相色谱法
第一法
2原理
样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，石油醚和无水乙醚混合提取，提取液浓缩至干，无水乙醇溶解定容后，采用气相色谱法检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯.水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1甲醇(CH.OH)：色谱纯。
3.1.2无水乙醇（C,HsOH）。
3.1.3石油醚：沸程30℃~60℃。3.1.4无水乙醚（C,HO)。
3.1.5无水硫酸钠（Na,SO,）。
3.1.6氢氧化钾(KOH)。
3.2试剂配制
60%氢氧化钾溶液：称取60g氢氧化钾，缓慢加水溶解，并定容至100mL。石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）：将石油醚和无水乙醚等体积混合均匀。3标准品
胆固醇标准品（C2.H46O.CAS号：57-88-5）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制
3.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）称取胆固醇标准品0.05g（精确至0.1mg），用无水乙醇溶解并定容至50mL，放置0℃～4℃密封1
可贮藏半年
3.4.2胆固醇标准系列工作液
GB5009.128—2016
分别吸取标准储备液（1.0mg/mL）25L、50μL、100μL、500μL、2000μL，用无水乙醇定容至10mL，该标准系列工作液的浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL。现用现配。4仪器和设备
4.1气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。电子天平：感量为1mg和0.1mg。4.2
匀浆机。
皂化装置。
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1肉及肉制品等各类固体试样取样品的可食部分200g进行均质。将试样装入密封的容器单，防正变质和成分变化。试样应在均质化24h内尽快分析。
5.1.2植物油脂、乳品等液体试样取混匀后的均匀液体试样装人密封容器单待测。5.2样品处理
5.2.1皂化
称取制备后的样品0.25g~10g（准确至0.001g，胆固醇含量约为0.5mg~5mg），于250mL圆底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，10mL60%氢氧化钾溶液，混匀。将试样在100℃磁力搅拌加热电热套皂化回流1h，不时振荡防止试样黏附在瓶壁上，皂化结束后，用5mL无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下圆底烧瓶，用流水冷却至室温。5.2.2提取
定量转移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次冲洗圆底烧瓶.洗液并人分液漏斗，再用40mL石油醚-无水乙醚混合液（1+十1.体积比）分2次～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，振摇2min，静置，分层。转移水相，合并三次有机相，用水每次100mL洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠脱水转移到150mL平底烧瓶中。5.2.3浓缩
将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解并定容至5mL，待气相色谱仪测定
不同试样的前处理需要同时做空白试验2
5.3测定
5.3.1仪器参考条件
GB5009.128—2016
色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱，柱长30m，内径0.32mm，粒径0.25um，或同等性能的色谱柱；
载气：高纯氮气，纯度≥99.999%：恒流2.4mL/min；b）
柱温（程序升温）：初始温度为200℃，保持1min，以30℃/min速率升至280℃，保持10min；进样口温度280℃；
检测器温度：290℃；
进样量：1μL；
进样方式：不分流进样，进样1min后开阀；空气流量：350mL/min；www.bzxz.net
氢气流量：30mL/min。
5.3.2标准曲线的制作
分别取胆固醇标准系列工作液注入气相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作标准曲线5.3.3测定
试样溶液注人气相色谱仪，测定峰面积，由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。根据保留时间定性，外标法定量。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.1。分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（1)计算：pxv
mx1000
式中：
试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样溶液中胆固醇的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；试样溶液最终定容的体积，单位为毫升（mL）；试样质量，单位为克（g）；
1000、100换算系数。
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
当称样量为0.5g，定容体积为5.0mL，方法的检出限为0.3mg/100g，定量限为1.0mg/100g。3
9原理
高效液相色谱法
第二法
GB5009.128—2016
样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，石油醚和无水乙醚混合提取，提取液浓缩至干，无水乙醇溶解定容后，采用高效液相色谱仪检测，外标法定量试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
甲醇（CH,OH)：色谱纯。
无水乙醇（C,H.OH)。
石油醚：沸程30℃～60℃。
无水乙醚（C,HO）。
无水硫酸钠（Na2SO,）。
氢氧化钾(KOH)。
试剂配制
60%氢氧化钾溶液：称取60g氢氧化钾，缓慢加水溶解，并定容至100mL。10.2.1
石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）：将石油醚和无水乙醚等体积混合均勾10.3标准品
胆固醇标准品（C27H4O.CAS号：57-88-5）：纯度≥99%。10.4标准溶液配制
10.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）：称取胆固醇标准品0.05g（精确至0.1mg），用无水乙醇溶解并定容至50mL，放置0℃～4℃密封可贮藏半年。2胆固醇标准系列工作液：分别吸取标准储备液（1.0mg/mL）25uL、50μuL、100μL、500μL、10.4.2
2000uL，用无水乙醇定容至10mL，该标准系列工作液的浓度分别为2.5μg/mL、5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL、200μg/mL。现用现配。11
仪器和设备
匀浆机。
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或相当的检测器电子天平：感量为1mg和0.1mg。11.3
2分析步骤
12.1试样制备
肉及肉制品等各类固体试样
GB5009.128—2016
样品取可食部分200g，使用绞肉机或匀浆机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化24h内尽快分析2乳品等液体试样
取混匀后的均匀液体试样装入密封容器里待测。12.2样品处理
12.2.1皂化
称取制备后的样品0.25g~10g（精确至0.001g，胆固醇含量约为0.5mg~5mg），于250mL圆底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，10mL60%氢氧化钾溶液，混匀。将试样在100℃磁力搅拌加热电热套皂化回流1h，不时振荡防正试样黏附在瓶壁上，皂化结束后，用5mL无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下圆底烧瓶，用流水冷却至室温。12.2.2提取
定量转移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次冲洗圆底烧瓶，洗液并人分液漏斗，再用40mL石油醚-无水乙醚混合液（1十1，体积比）分2次～3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗，振摇2min，静置.分层。转移水相，合并三次有机相，用水每次100mL洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇.防正乳化，提取液通过约10g无水硫酸钠脱水转移到150mL平底烧瓶中。12.2.3浓缩
将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干，用无水乙醇溶解并定容至5mL.溶液通过0.45um过滤膜，收集滤液于进样瓶中，待高效液相色谱仪测定不同试样的前处理需要同时做空白试验。12.3测定
仪器参考条件
色谱柱：C反相色谱柱，柱长4.6mm，内径150mm，粒径5um，或同等性能的色谱柱；b）柱温：38℃；
流动相：甲醇；
流速：1.0mL/min；
测定波长：205nm；
进样量：10μL。
标准曲线的制作
分别取10L胆固醇标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，制作标准曲线5
12.3.3测定
GB5009.128—2016
将10uL试样溶液注人高效液相色谱仪，测定峰面积，由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.2。13
分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（2)计算：pxv
mX1000
式中：
试样中胆固醇的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；试样溶液中胆固醇的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；试样溶液定容体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g)；
换算系数
1000、100
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5其他
.（2)
当称样量为1g，定容体积为5mL，方法的检出限为0.64mg/100g，定量限为2.1mg/100g。第三法比色法
16原理
样品进行脂肪提取后的油脂，经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，用石油醚提取，浓缩后加入冰乙酸以硫酸铁铵试剂作为显色剂，采用分光光度计，在560nm～575nm波长下检测，外标法定量。17
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水17.1试剂
无水乙醇(C,H,OH)。
石油醚：沸程30℃~60℃。
硫酸（H,SO)。
冰乙酸（CH,O2）：优级纯。
磷酸(H,PO,)。
硫酸铁铵[FeNH,（SO,)，·H,O]钢瓶氮气（N2）：纯度99.99%。海砂。
氢氧化钾（KOH)。
氢氧化钠(NaOH)。
盐酸（HCI)。
乙醚(C,H,O)。
17.2试剂配制
GB5009.128—2016
铁矾储备液：称取4.463g硫酸铁铵[FeNH（SO,）2·H,O]于100mL磷酸中（如果不能充分溶解，超声后取上清液），贮藏于干燥器内，此液在室温中稳定。17.2.2
铁矾显色液：吸取铁矾储备液10mL用硫酸定容至100mL。贮藏于干燥器内，以防吸水。50%氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用水溶解，并定容至100mL。17.2.3
5%氯化钠溶液：称取5g氯化钠用水溶解，并定容至100mL。17.2.5
盐酸溶液(1十1)：将盐酸与水等体积混合均匀。氢氧化钠溶液（240g/L）：称取24g氢氧化钠，用水溶解并定容至100mL17.2.7海砂：取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用盐酸溶液（1+1）煮沸0.5h，用水洗至中性再用氢氧化钠溶液（240g/L）煮沸0.5h.用水洗至中性，经100℃土5℃干燥备用。17.3标准品
胆固醇标准品（C2.HOCAS号：57-88-5）：纯度≥99%。17.4标准溶液配制
17.4.1胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）：称取胆固醇标准品0.10g（精确至0.1mg），用冰乙酸溶解并定容至100mL。放置4℃密封可贮藏半年。17.4.2胆固醇标准工作液（100μg/mL）：吸取胆固醇标准储备液（1.0mg/mL）10mL，用冰乙酸定容至100mL。现用现配。
仪器和设备
18.1匀浆机。
分光光度计
18.3电子天平：感量为1mg和0.1mg。19
分析步骤
胆固醇标准曲线的制作
吸取胆固醇标准工作液0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL分别置于10mL试管中，在各管内加人冰乙酸使总体积均达4mL。沿管壁加人2mL铁矾显色液，混匀，在15min～90min内，在560nm575nm波长下比色。以胆固醇标准浓度为横座标，吸光度为纵坐标制作标准曲线19.2测定
食品中脂肪的提取与测定
根据食品种类分别用索氏脂肪提取法，研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。并计算出每100g食品中的脂肪含量。
2食品中胆固醇的测定
GB 5009.128—2016
将提取的油脂3滴～4滴（约含胆固醇300μg～500μg），置于25mL试管中，准确记录其质量。加人4mL无水乙醇，0.5mL50%氢氧化钟溶液.混匀，装上冷凝管，在65℃恒温水浴锅中皂化1h。皂化时每隔20min～30min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，用流水冷却。加入3mL5%氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻璃塞，在电动振荡器上振摇2min，静置分层（一般约需1h以上）。取上层石油醚液2mL.置于10mL具塞玻璃试管内，在65℃水浴中用氮气吹干.加入4mL冰乙酸，2mL铁矾显色液，混匀放置15min后在560nm～575nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。
不同试样的前处理需要同时做空白试验。20
分析结果的表述
试样中胆固醇的含量按式（3)计算：AxcxVi
,Xmx1000
式中：
试样中胆固醇含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；测得的吸光度值在胆固醇标准曲线上的胆固醇含量，单位为微克（ug）；试样中脂肪含量，单位为克每百克（g/100g）；石油醚总体积，单位为毫升（mL）；取出的石油醚体积，单位为毫升（mL）；称取食品油脂试样量，单位为克（g）；换算系数。
计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。21
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。22其他
方法的检出限为2.4mg/100g，定量限为7.2mg/100g。（3）
附录A
胆固醇标准的色谱图
胆固醇标准溶液的气相色谱图见图A.1。PM3
450寸
250号
200元
150号
胆固醇标准溶液的气相色谱图
A.2胆固醇标准溶液的高效液相色谱图见图A.2。0.14
胆固醇标准溶液的高效液相色谱图10
GB5009.128—2016
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