GB 5009.248-2016
基本信息
标准号： GB 5009.248-2016
中文名称：食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
GB 5009.248-2016 食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定
GB5009.248-2016
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标准内容
中华人民共和国国家标准
GB5009.248—2016
食品安全国家标准
食品中叶黄素的测定
2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
GB5009.248—2016
本标准代替GB/T23209—2008《奶粉中叶黄素的测定液相色谱-紫外检测法》本标准与GB/T23209—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中叶黄素的测定”；扩大适用范围，增加在冷冻饮品、米面制品、焙烤食品、果酱、果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定方法；
对原标准的原理进行了修改，把原用丙酮为溶剂提取改为用乙醚-正已烷-环已烷溶剂体系进行提取；
增加操作过程的注意点；
增加了对包括奶粉在内的脂肪含量高的样品的皂化步骤，并提供了不同前处理方法以适应各种样品基质分析需要；
一增加了对叶黄素标准溶液浓度的校正要求；对于在试验操作过程中叶黄素可能产生异构化的现象，增加了对因异构化生成的顺式叶黄素的定性与定量要求。
1范围
食品安全国家标准
食品中叶黄素的测定
本标准规定了食品中叶黄素的液相色谱测定方法。GB5009.248—2016
本标准适用于婴幼儿配方奶粉、乳品、冷冻饮品、米面制品、焙烤食品、果酱、果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定
2原理
脂肪含量高（脂肪含量以干基计不低于3%）的食品经氢氧化钾溶液室温皂化使叶黄素游离后，再以乙醚-正已烷-环已烷（40十40十20，体积比）提取，液相色谱法分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测、外标法定量
其他食品直接以乙醚-正已烷-环已烷（40十40十20，体积比）提取样品中叶黄素。提取液经中性氧化铝固相萃取小柱净化后，液相色谱法分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。样品在提取与分析过程中，反式结构的叶黄素可能发生异构化.转化为顺式叶黄素。对于转化产生的顺式叶黄素，可通过保留时间定性、峰面积加合定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1环已烷（C,Ha）：色谱纯。3.1.2乙醚［（C,H.),O]：色谱纯。3.1.3正己烷（C,H1。）：色谱纯3.1.4无水乙醇（CH,OH)：色谱纯3.1.5甲基叔丁基醚［CHOCC(CH，），MTBE]：色谱纯。3.1.6
二丁基羟基甲苯（CisH2O,BHT)。氢氧化钾（KOH)。
3.1.8碘(I2)。
3.2试剂配制
3.2.110%氢氧化钾溶液：称取10g氢氧化钾（3.1.7）.加水溶解稀释至100mL。3.2.220%氢氧化钾溶液：称取20g氢氧化钾（3.1.7），加水溶解稀释至100mL。3.2.3萃取溶剂：称取1gBHT（3.1.6），以200mL环己烷（3.1.1）溶解，加入400mL乙醚（3.1.2）和400mL正已烷（3.1.3），混勺。3.2.40.1%BHT乙醇溶液：称取0.1gBHT（3.1.6），以100mL乙醇（3.1.4）溶解，混匀。3.2.5碘的乙醇溶液：称取1mg碘（3.1.8），加乙醇（3.1.4)溶解稀释至1L。1
3.3标准品
叶黄素（CAS号：127-40-2），纯度不低于98.0%。3.4标准溶液配制
GB5009.248—2016
3.4.1标准储备液（50μg/mL）：准确称取5mg（精确至0.01mg）叶黄素（3.1.3），以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）溶解并定容至100mL。该标准储备液充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中可保存六个月注：叶黄素标准储备液使用前需校正，具体操作见附录A，3.4.2标准工作液：从叶黄素标准贮备液（3.4.1）中准确移取0.050mL、0.100mL、0.200mL、0.400mL1.00mL溶液人5个25mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）定容至刻度，得到浓度为0.100μg/mL、0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.800μg/mL、2.00uμg/mL的系列标准工作液。标准工作液充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中可保存一个月3.5中性氧化铝固相萃取小柱，500mg/3mL，使用前以5mL萃取溶剂（3.2.3）淋洗保持柱体湿润3.60.45μm滤膜，有机系。
4仪器和设备
液相色谱仪，带二极管阵列检测器或紫外检测器4.2
紫外可见分光光度计。
分析天平：感量0.01mg和0.01g。4.4
组织捣碎机。
旋涡振荡器。
振荡器。
减压浓缩装置。
固相萃取装置
离心机：转速不低于4500r/min。5分析步骤
注：由于叶黄素对光敏感，除非另行说明，所有试验操作应在无500nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行。
5.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中。制备好的试样应充氮密封后置于一20℃或以下的冰箱中保存。5.2提取
5.2.1脂肪含量高的食品（如婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类食品等）准确称取2g（精确至0.01g）均匀试样于50mL聚丙烯离心管中，加人约0.2gBHT（3.1.6）和10mL乙醇（3.1.4）混勾，加入10mL10%氢氧化钟溶液（3.2.1），涡旋振荡1min混匀，室温避光振荡皂化30min，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振荡提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，以10mL水洗涤，4500r/min离心3min分层，重复洗涤1次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至5mL，过0.45um滤膜2
（3.6），供液相色谱测定。
GB5009.248—2016
液态奶：准确称取10g（精确至0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，加入约0.2gBHT（3.1.6）和10mL乙醇（3.1.4），混匀，加人2mL20%的氢氧化钾溶液（3.2.2），涡动1min混匀，室温避光振荡皂化30min，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振汤提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，以10mL水洗涤，4500r/min离心3min分层，重复洗涤1次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至25mL，过0.45um滤膜（3.6）.供液相色谱测定。
5.2.2其他食品（如米、面制品、果酱等）准确称取5g（精确至0.01g）均匀样品置于50mL聚丙烯离心管中，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振荡提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，于室温减压浓缩至近干，以3mL萃取溶剂（3.2.3）涡旋振荡溶解，重复操作1次，合并萃取溶剂，混匀，待净化。将上述溶液以约1mL/min的流速过已活化的中性氧化铝固相萃取小柱（3.5），用3mL萃取溶剂（3.2.3)洗脱，合并流出液与洗脱液：于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至10mL，过0.45um滤膜（3.6），供液相色谱测定。5.31
仪器参考条件
5.3.1色谱柱：C30色谱柱，5μm，250mmX4.6mm（内径）或相当者；5.3.2柱温：30℃；此内容来自标准下载网
5.3.3流动相：甲醇/水（88十12，体积比，含0.1%BHT)-甲基叔丁基醚（含0.1%BHT），梯度洗脱，0min~18min，甲醇/水由100%变换至10%；18.1min，甲醇/水由10%变换至100%，保留10min。5.3.4流速：1.0mL/min；
5.3.5检测波长：445nm；
5.3.6进样量：50μL
5.4标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注人液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.5试样溶液的测定
待测样液中叶黄素的响应值应在仪器线性响应范围内，否则应适当稀释或浓缩。标准工作液与待测样液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性（待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在士2.5%之内），外标法定量。平行测定次数不少于两次。叶黄素标准溶液液相色谱图参见附录B图B.1。注：由于在样品的提取与分析过程中.温度、光照等原因均可使反式结构的叶黄素发生异构化，转化为顺式叶黄素。可按以下步骤获得顺式叶黄素：以乙醇为溶剂.配制800ug/L的叶黄素标准溶液50mL.加入2mL碘的乙醇溶液（3.2.5）.播匀.混合液在日光或日光灯下放置30min。可获得顺式结构的叶黄素。由此制备的含顺式结构的叶黄素在检测时可作为对照品。经光碘异构化的反式叶黄素标准溶液色谱图参见附录B图B.2。6分析结果的表述
试样中叶黄素含量按式（1)计算：3
式中：
X--试样中叶黄素的含量，单位为微克每百克（μg/100g)；由标准曲线而得的样液中标准品的含量，单位为微克每毫升（ug/mL)；样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；m
称样量，单位为克（g）：
GB5009.248—2016
校正系数。可通过以下方式获得：用液相色谱分析试样溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
本方法的检出限：婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类等食品，当取样量为2g、定容体积为5mL时，检出限为3ug/100g；液态奶等，当取样量为10g、定容体积为25mL时，检出限为3ug/100g；米、面制品、果酱等食品，当取样量为5g、定容体积为10mL时，检出限为3ug/100g。本方法的定量限：婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类等食品，当取样量为2g、定容体积为5mL时.定量限为10μg/100g；液态奶等当取样量为10g、定容体积为25mL时，定量限为10μg/100g；米、面制品、果酱等食品，当取样量为5g、定容体积为10mL时，定量限为10μg/100g。4
附录A
标准溶液浓度校正方法
GB5009.248—2016
叶黄素标准溶液配制后需要校准。取1mL标准贮备液，以乙醇定容至25mL。移取该溶液至1cm的石英比色皿中，以乙醇为空白，以分光光度计在445nm波长下测定吸光值A。按式（A.1)计算标准溶液浓度：
X2500XF
式中：
标准溶液浓度，ug/mL；
标准溶液的吸光值；
转换系数；
乙醇中叶黄素的吸光系数，为2550；...（A.1)
校正系数，可按下述方式获得：用液相色谱分析校准后的标准溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。
B.1叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图附录B
标准溶液液相色谱图
叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图见图B.1。0. 10-
叶黄茶
叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图B.2经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图见图B.20. 10-
说明：
顺式结构的叶黄素；
反式结构的叶黄素。
经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图GB5009.248—2016
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食品安全国家标准
食品中叶黄素的测定
2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
GB5009.248—2016
本标准代替GB/T23209—2008《奶粉中叶黄素的测定液相色谱-紫外检测法》本标准与GB/T23209—2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品中叶黄素的测定”；扩大适用范围，增加在冷冻饮品、米面制品、焙烤食品、果酱、果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定方法；
对原标准的原理进行了修改，把原用丙酮为溶剂提取改为用乙醚-正已烷-环已烷溶剂体系进行提取；
增加操作过程的注意点；
增加了对包括奶粉在内的脂肪含量高的样品的皂化步骤，并提供了不同前处理方法以适应各种样品基质分析需要；
一增加了对叶黄素标准溶液浓度的校正要求；对于在试验操作过程中叶黄素可能产生异构化的现象，增加了对因异构化生成的顺式叶黄素的定性与定量要求。
1范围
食品安全国家标准
食品中叶黄素的测定
本标准规定了食品中叶黄素的液相色谱测定方法。GB5009.248—2016
本标准适用于婴幼儿配方奶粉、乳品、冷冻饮品、米面制品、焙烤食品、果酱、果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定
2原理
脂肪含量高（脂肪含量以干基计不低于3%）的食品经氢氧化钾溶液室温皂化使叶黄素游离后，再以乙醚-正已烷-环已烷（40十40十20，体积比）提取，液相色谱法分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测、外标法定量
其他食品直接以乙醚-正已烷-环已烷（40十40十20，体积比）提取样品中叶黄素。提取液经中性氧化铝固相萃取小柱净化后，液相色谱法分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。样品在提取与分析过程中，反式结构的叶黄素可能发生异构化.转化为顺式叶黄素。对于转化产生的顺式叶黄素，可通过保留时间定性、峰面积加合定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1环已烷（C,Ha）：色谱纯。3.1.2乙醚［（C,H.),O]：色谱纯。3.1.3正己烷（C,H1。）：色谱纯3.1.4无水乙醇（CH,OH)：色谱纯3.1.5甲基叔丁基醚［CHOCC(CH，），MTBE]：色谱纯。3.1.6
二丁基羟基甲苯（CisH2O,BHT)。氢氧化钾（KOH)。
3.1.8碘(I2)。
3.2试剂配制
3.2.110%氢氧化钾溶液：称取10g氢氧化钾（3.1.7）.加水溶解稀释至100mL。3.2.220%氢氧化钾溶液：称取20g氢氧化钾（3.1.7），加水溶解稀释至100mL。3.2.3萃取溶剂：称取1gBHT（3.1.6），以200mL环己烷（3.1.1）溶解，加入400mL乙醚（3.1.2）和400mL正已烷（3.1.3），混勺。3.2.40.1%BHT乙醇溶液：称取0.1gBHT（3.1.6），以100mL乙醇（3.1.4）溶解，混匀。3.2.5碘的乙醇溶液：称取1mg碘（3.1.8），加乙醇（3.1.4)溶解稀释至1L。1
3.3标准品
叶黄素（CAS号：127-40-2），纯度不低于98.0%。3.4标准溶液配制
GB5009.248—2016
3.4.1标准储备液（50μg/mL）：准确称取5mg（精确至0.01mg）叶黄素（3.1.3），以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）溶解并定容至100mL。该标准储备液充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中可保存六个月注：叶黄素标准储备液使用前需校正，具体操作见附录A，3.4.2标准工作液：从叶黄素标准贮备液（3.4.1）中准确移取0.050mL、0.100mL、0.200mL、0.400mL1.00mL溶液人5个25mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）定容至刻度，得到浓度为0.100μg/mL、0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.800μg/mL、2.00uμg/mL的系列标准工作液。标准工作液充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中可保存一个月3.5中性氧化铝固相萃取小柱，500mg/3mL，使用前以5mL萃取溶剂（3.2.3）淋洗保持柱体湿润3.60.45μm滤膜，有机系。
4仪器和设备
液相色谱仪，带二极管阵列检测器或紫外检测器4.2
紫外可见分光光度计。
分析天平：感量0.01mg和0.01g。4.4
组织捣碎机。
旋涡振荡器。
振荡器。
减压浓缩装置。
固相萃取装置
离心机：转速不低于4500r/min。5分析步骤
注：由于叶黄素对光敏感，除非另行说明，所有试验操作应在无500nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行。
5.1试样制备
将一定数量的样品按要求经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中。制备好的试样应充氮密封后置于一20℃或以下的冰箱中保存。5.2提取
5.2.1脂肪含量高的食品（如婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类食品等）准确称取2g（精确至0.01g）均匀试样于50mL聚丙烯离心管中，加人约0.2gBHT（3.1.6）和10mL乙醇（3.1.4）混勾，加入10mL10%氢氧化钟溶液（3.2.1），涡旋振荡1min混匀，室温避光振荡皂化30min，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振荡提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，以10mL水洗涤，4500r/min离心3min分层，重复洗涤1次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至5mL，过0.45um滤膜2
（3.6），供液相色谱测定。
GB5009.248—2016
液态奶：准确称取10g（精确至0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，加入约0.2gBHT（3.1.6）和10mL乙醇（3.1.4），混匀，加人2mL20%的氢氧化钾溶液（3.2.2），涡动1min混匀，室温避光振荡皂化30min，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振汤提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，以10mL水洗涤，4500r/min离心3min分层，重复洗涤1次，合并有机相于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至25mL，过0.45um滤膜（3.6）.供液相色谱测定。
5.2.2其他食品（如米、面制品、果酱等）准确称取5g（精确至0.01g）均匀样品置于50mL聚丙烯离心管中，以10mL萃取溶剂（3.2.3）避光涡旋振荡提取3min，4500r/min离心3min，重复提取2次，合并提取液，于室温减压浓缩至近干，以3mL萃取溶剂（3.2.3）涡旋振荡溶解，重复操作1次，合并萃取溶剂，混匀，待净化。将上述溶液以约1mL/min的流速过已活化的中性氧化铝固相萃取小柱（3.5），用3mL萃取溶剂（3.2.3)洗脱，合并流出液与洗脱液：于室温减压浓缩至近干，以0.1%BHT乙醇溶液（3.2.4）涡旋振荡溶解残渣并定容至10mL，过0.45um滤膜（3.6），供液相色谱测定。5.31
仪器参考条件
5.3.1色谱柱：C30色谱柱，5μm，250mmX4.6mm（内径）或相当者；5.3.2柱温：30℃；此内容来自标准下载网
5.3.3流动相：甲醇/水（88十12，体积比，含0.1%BHT)-甲基叔丁基醚（含0.1%BHT），梯度洗脱，0min~18min，甲醇/水由100%变换至10%；18.1min，甲醇/水由10%变换至100%，保留10min。5.3.4流速：1.0mL/min；
5.3.5检测波长：445nm；
5.3.6进样量：50μL
5.4标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注人液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.5试样溶液的测定
待测样液中叶黄素的响应值应在仪器线性响应范围内，否则应适当稀释或浓缩。标准工作液与待测样液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性（待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在士2.5%之内），外标法定量。平行测定次数不少于两次。叶黄素标准溶液液相色谱图参见附录B图B.1。注：由于在样品的提取与分析过程中.温度、光照等原因均可使反式结构的叶黄素发生异构化，转化为顺式叶黄素。可按以下步骤获得顺式叶黄素：以乙醇为溶剂.配制800ug/L的叶黄素标准溶液50mL.加入2mL碘的乙醇溶液（3.2.5）.播匀.混合液在日光或日光灯下放置30min。可获得顺式结构的叶黄素。由此制备的含顺式结构的叶黄素在检测时可作为对照品。经光碘异构化的反式叶黄素标准溶液色谱图参见附录B图B.2。6分析结果的表述
试样中叶黄素含量按式（1)计算：3
式中：
X--试样中叶黄素的含量，单位为微克每百克（μg/100g)；由标准曲线而得的样液中标准品的含量，单位为微克每毫升（ug/mL)；样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；m
称样量，单位为克（g）：
GB5009.248—2016
校正系数。可通过以下方式获得：用液相色谱分析试样溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
本方法的检出限：婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类等食品，当取样量为2g、定容体积为5mL时，检出限为3ug/100g；液态奶等，当取样量为10g、定容体积为25mL时，检出限为3ug/100g；米、面制品、果酱等食品，当取样量为5g、定容体积为10mL时，检出限为3ug/100g。本方法的定量限：婴幼儿配方奶粉、乳粉、冰淇淋、焙烤坚果类等食品，当取样量为2g、定容体积为5mL时.定量限为10μg/100g；液态奶等当取样量为10g、定容体积为25mL时，定量限为10μg/100g；米、面制品、果酱等食品，当取样量为5g、定容体积为10mL时，定量限为10μg/100g。4
附录A
标准溶液浓度校正方法
GB5009.248—2016
叶黄素标准溶液配制后需要校准。取1mL标准贮备液，以乙醇定容至25mL。移取该溶液至1cm的石英比色皿中，以乙醇为空白，以分光光度计在445nm波长下测定吸光值A。按式（A.1)计算标准溶液浓度：
X2500XF
式中：
标准溶液浓度，ug/mL；
标准溶液的吸光值；
转换系数；
乙醇中叶黄素的吸光系数，为2550；...（A.1)
校正系数，可按下述方式获得：用液相色谱分析校准后的标准溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。
B.1叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图附录B
标准溶液液相色谱图
叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图见图B.1。0. 10-
叶黄茶
叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图B.2经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图见图B.20. 10-
说明：
顺式结构的叶黄素；
反式结构的叶黄素。
经光碘异构化的叶黄素（反式）标准溶液液相色谱图GB5009.248—2016
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