GB/T 33108-2016
基本信息
标准号： GB/T 33108-2016
中文名称：海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 33108-2016 海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法
GB/T33108-2016
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标准内容
1CS 67.120
中华人民共和国国家标准
GB/T33108--2016
海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法
Determination of sea cucumber glycosides in sea cucumber and seacucumber products-
High performance liquid chromatography2016-10-13发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2017-05-01实施
中华人民共和国
国家标准
海参及其制品中海参皂苔的测定高效液相色谱法
GB/T 33108--2016
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址 spc.net.cn
总编室：(010)68533533发行中心：(010)51780238读者服务部：（010）68523946
中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16印张0.75字数15千字2016年11月第一版2016年11月第一次印刷书号：1550661-54731定价16.00元由本社发行中心调换
如有印装差错
侵权必究
版权专有
举报电话：（010)68510107
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本标准起草单位：青岛市产品质量监督检验研究院，中国海洋大学。本标准主要起草人：薛长湖、李昭勇、樊燕、刘小芳、武千钧、杨洁。GB/T331082016
1范围
海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法
本标准规定了海参及其制品中海参皂苷含量的高效液相色谱测定方法。GB/T33108-2016
本标准适用于海参及其制品中海参皂苷含量（以喹诺糖计）的测定，喹诺糖为海参皂苷特征性单糖。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T30891水产品抽样方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
喹诺糖quinovose
6-脱氧葡萄糖6-Deoxy-D-gulcose分子式C.Hi2O5，相对分子质量164.16广泛存在于海参皂苷糖链中，每个海参皂苷分子中有且仅含有个喹诺糖单元。3.2
海参苔 sea cucumber glycosides由羊毛烷衍生物和低聚糖组成的三菇皂苷化合物，其中喹诺糖为其稳定的特征性单糖。4源理
样品经乙醇提取、正丁醇萃取得到海参皂苷，再经三氟乙酸水解，水解液中喹诺糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生反应，产物经C1：色谱柱分离，高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量，以喹诺糖含量标示样品中海参皂苷的含量。5°试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.1水为符合GB/T6682规定的—级水。5.2申醇（CHOH）：色谱纯。
5.3乙腈(CH;CN）：色谱纯。
5.4 乙醇(CH:CH2OH)。
GB/T 33108 ---2016
正丁醇[CH(CH2)2CH,OH]。
三氯甲烷（CHCI）：色谱纯。
5.7氢氧化钠(NaOH)。
5.8盐酸(HCI)。
5.9磷酸二氢钾（KH,PO4）。
5.10三氟乙酸（CFCOOH)。bzxz.net
5.111-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)：使用前用甲醇重结晶两次。将PMP加人到甲醇中加热（60℃~64℃)溶解制成饱和溶液，冰水混合物冷却，析出晶体，抽滤洗涤晶体，重复结晶一次，5.12
喹诺糖标准品：纯度≥98.0%，CAS号7658-08-4。乙醇溶液（60%）：量取60mL乙醇，加40mL水，混匀。盐酸溶液（0.3mol/L）)：量取2.5mL分析纯盐酸（5.8），用水稀释并定容至100mL。三氟乙酸溶液（2mol/L）：称取22.8g=氟乙酸（5.10），用水稀释并定容至100mL。氢氧化钠溶液（4mol/L）：称取16.0g氢氧化钠（5.7），用水稀释并定容至100mL。氢氧化钠溶液（0.3mol/L）：称取1.2g氢氧化钠（5.7)，用水稀释并定容至100mL。PMP衍生剂溶液（0.5mol/）：称取8.71g重结晶后的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)（5.11），用甲醇溶解并定容至100 mL。4℃保存,有效期1个月。5.19诺糖标准储备液（324mg/L）：称取喹诺糖标准品（5.12）3.24mg，用水溶解并定容至10mL4C密封保存，有效期1个月。
5.20喹诺糖标准工作液：准确移取适量喹诺糖标准储备液（5.19），用水稀释成浓度为6.48mg/L，12.96mg/L，19.44mg/L，25.92mg/L，32.4mg/L的喹诺糖系列标准.作液，当天配制，现用现配。5.210.05mol/L磷酸盐缓冲溶液：称取6.80g磷酸二氢钾（5.9），溶于约900mL水中，用氢氧化钠溶液（5.16）调节pH至5.1~5.3，用水定容至1L，0.45m滤膜过滤，现用现配。5.22.磷酸盐-乙腈溶液：取乙腈（5.3)220mL，用0.05mol/1.磷酸盐缓冲溶液（5.21）稀释至1000mL，用氢氧化钠溶液（5.16）调节pH至5.2。6
仪器和设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器。6.1
6.2分析天平：精度0.01mg。
6.3均质机。
6.4涡旋振荡器。
6.5高速万能粉碎机。
6.6旋转蒸发仪。
恒温水浴。
6.8微孔滤膜：0.45pm。
6.9反应管：15mL，螺口，带聚四氟乙烯衬垫。6.105mL容量瓶。
6.115 mL安瓶。
10mL具塞试管。
7．测定方法
7.1抽样
产品抽样按GB/T30891的规定进行。2
7.2试样制备
7.2.1鲜海参
去肠腺、灰嘴，剪成约0.5cm×0.5cm的小块，句浆备用。7.2.2干海参
粉碎，过0.850mm筛，混匀备用。7.2.3即食海参及盐渍海参
剪成约0.5cm×0.5cm的小块，匀浆备用。7.2.4其他海参制品
直接粉碎、勾浆或混匀，备用。7.3海参皂苷的提取
7.3.1固体样品
GB/T 33108--2016
粉末状试样称取约2g（精确至0.01g），匀浆试样称取约10g（精确至0.01g），加人40mL乙醇溶液（5.13），回流提取1h，重复提取3次，合并乙醇提取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发除去乙醇，提取物用20mL水溶解，加人20mL正丁醇，充分振荡，静置分层，吸取上层正丁醇层，按上述方法用正丁醇重复萃取3次，合并正了醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至于，即得海参皂粗提物。7.3.2液体样品
准确移取20mL～50mL样品于分液漏斗中，加人等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至干，郎得海参皂营粗提物。7.4水解
将7.3得到的粗提物溶解于2mL三氟乙酸溶液（5.15）后，转移至5mL安额瓶中，充氮封管，120℃水解2h，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.16）中和至pH值为6.5~7.5后转移人10mL具塞试管中，加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法重复萃取3次，将上层水相转移至5mL容量瓶中，用水定容至5mL，即得海参皂昔水解液。7.5衍生及净化
7.5.1衍生
推确移取7.4制备的试样海参皂苷水解液250uL于15mL反应管牛，加人250uLPMP衍生剂溶液（5.18）和250μL的NaOH溶液（5.17），涡旋混合混匀，70C水浴反应30min，取出冷却至室温，加250uL盐酸溶液（5.14），祸旋混合。7.5.2净化
加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45um滤膜，供高效液相色谱分析。3
GB/T 33108--2016
7.6标准工作曲线制作
准确移取浓度为6.48mg/L，12.96mg/L，19.44mg/L，25.92mg/L，32.4mg/L的诺糖标准工作液（5.20）250uL于15mL具塞反应管中，加人250uLPMP衍生剂溶液（5.18）和250uL的氢氧化钠溶液（5.17），祸旋混合混匀后，70℃水浴反应30min，取出冷却至室温，加250L盐酸溶液（5.14），涡旋混合。
加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃奔下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45μm滤膜。以喹诺糖标准工作溶液浓度为横坐标，以座诺糖衍生物峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。
空自试验
除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。7.8平行试验
对同试样进行平行试验测定。
7.9测定
液相色谱参考条件
色谱柱：Cia柱，150mm×4.6mm，5um或其他性能相当。7.9.1.1
柱溫:25 ℃。
7.9.1.3检测波长：250nm。
7.9.1.4进样量：20μL。
7.9.1.5流速：1.0mL/min。
7.9.1.6流动相：磷酸盐-乙腈溶液（5.22）。色谱分析
分别注人20μL喹诺糖系列标准衍生液（7.6）试样衍生液（7.5）和空白衍生液（7.7）于高效液相色谱仪中，按7.9.1规定的色谱条件进行分析，记录峰面积，试样液中喹诺糖衍生物的响应值均应在标准曲线范围之内。根据标准品的保留时间定性，外标法定量。喹诺糖标准溶液衍生物和试样液衍生物液相色谱图参见附录A。
7.10结果计算与表述
7.10.1试样中海参皂苷的含量（以喹诺糖计)按式(1)计算：X (cu co) × 5
式中：
（1）
试样中海参皂苷的含量（以喹诺糖计），单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；试样海参皂苷水解液中喹诺糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；-空白水解液中喹诺糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；试样海参皂苷水解液的定容体积，单位为毫升（mL）；试样的质量或试样体积，单位为克（g）或毫升（ml.）。计算结果保留三位有效数字。
7.10.2海参皂营与喹诺糖的换算参照附录B。8方法灵敏度、准确度和精密度
灵敏度
本方法定量限：固体样品5.0mg/kg，液体样品1.0mg/L。8.2准确度
本方法喹诺糖在固体样品中添加回收率8.3精密度
GB/T33108---2016
主液体样品中添加回收率为95%～110%。本方法批内相对标准端差≤10%，批间相对标准偏差≤15%GB/T 33108—2016
A.1噻诺糖行生物标准色谱图
座诺糖衍生物标准色谱图见图A.1mAU
A.2干海参中隆诺糖衍生物色谱图附录A
（资料性附录）
液相色谱图
喹诺糖衍生物标准色谱图
千海参中噻诺糖衍生物色谱图见图A.2mAU
干海参中隆诺糖生物色谱图
A.3海参口服液中隆诺糖衍生物色谱图海参口服液中喹诺糖衍生物色谱图见图A.3。6
海参口服液中隆诺糖行生物色谱图GB/T33108—2016
GB/T33108--2016
B.1海参皂苷的含量计算
（资料性附录）
海参皂苷与喹诺糖的换算
试样中海参皂苷的含量按式（B.1）进行计算，计算结果保留三位有效数字。X-XF
式中：
X.-试样中海参皂苷的含量，单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）-试样中喹诺糖的含量，单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；F
一喹诺糖换算为海参皂苷的系数。B.2不同品种海参中海参皂苷的换算系数不同品种海参中海参皂苷与喹诺糖的换算系数见表B.1。表B.1不同品种海参中海参皂苷与喹诺糖的换算系数海参品种
刺参(Apostichopus japonicus)革皮氏海参（Holothuria atra）黑海参（Holothuria atra）
北极海参（Holothuria mezicana）靴参(Actinopyga echinites)
糙海参（Holothunmscobra）
乌皱参(Actbmpyga miliaris）
GB/T 33108-2016
换算系数 F
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书号：155066：1-54731
定价：
9107-80188/0
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1范围
海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法
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3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
喹诺糖quinovose
6-脱氧葡萄糖6-Deoxy-D-gulcose分子式C.Hi2O5，相对分子质量164.16广泛存在于海参皂苷糖链中，每个海参皂苷分子中有且仅含有个喹诺糖单元。3.2
海参苔 sea cucumber glycosides由羊毛烷衍生物和低聚糖组成的三菇皂苷化合物，其中喹诺糖为其稳定的特征性单糖。4源理
样品经乙醇提取、正丁醇萃取得到海参皂苷，再经三氟乙酸水解，水解液中喹诺糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生反应，产物经C1：色谱柱分离，高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量，以喹诺糖含量标示样品中海参皂苷的含量。5°试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.1水为符合GB/T6682规定的—级水。5.2申醇（CHOH）：色谱纯。
5.3乙腈(CH;CN）：色谱纯。
5.4 乙醇(CH:CH2OH)。
GB/T 33108 ---2016
正丁醇[CH(CH2)2CH,OH]。
三氯甲烷（CHCI）：色谱纯。
5.7氢氧化钠(NaOH)。
5.8盐酸(HCI)。
5.9磷酸二氢钾（KH,PO4）。
5.10三氟乙酸（CFCOOH)。bzxz.net
5.111-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)：使用前用甲醇重结晶两次。将PMP加人到甲醇中加热（60℃~64℃)溶解制成饱和溶液，冰水混合物冷却，析出晶体，抽滤洗涤晶体，重复结晶一次，5.12
喹诺糖标准品：纯度≥98.0%，CAS号7658-08-4。乙醇溶液（60%）：量取60mL乙醇，加40mL水，混匀。盐酸溶液（0.3mol/L）)：量取2.5mL分析纯盐酸（5.8），用水稀释并定容至100mL。三氟乙酸溶液（2mol/L）：称取22.8g=氟乙酸（5.10），用水稀释并定容至100mL。氢氧化钠溶液（4mol/L）：称取16.0g氢氧化钠（5.7），用水稀释并定容至100mL。氢氧化钠溶液（0.3mol/L）：称取1.2g氢氧化钠（5.7)，用水稀释并定容至100mL。PMP衍生剂溶液（0.5mol/）：称取8.71g重结晶后的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)（5.11），用甲醇溶解并定容至100 mL。4℃保存,有效期1个月。5.19诺糖标准储备液（324mg/L）：称取喹诺糖标准品（5.12）3.24mg，用水溶解并定容至10mL4C密封保存，有效期1个月。
5.20喹诺糖标准工作液：准确移取适量喹诺糖标准储备液（5.19），用水稀释成浓度为6.48mg/L，12.96mg/L，19.44mg/L，25.92mg/L，32.4mg/L的喹诺糖系列标准.作液，当天配制，现用现配。5.210.05mol/L磷酸盐缓冲溶液：称取6.80g磷酸二氢钾（5.9），溶于约900mL水中，用氢氧化钠溶液（5.16）调节pH至5.1~5.3，用水定容至1L，0.45m滤膜过滤，现用现配。5.22.磷酸盐-乙腈溶液：取乙腈（5.3)220mL，用0.05mol/1.磷酸盐缓冲溶液（5.21）稀释至1000mL，用氢氧化钠溶液（5.16）调节pH至5.2。6
仪器和设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器。6.1
6.2分析天平：精度0.01mg。
6.3均质机。
6.4涡旋振荡器。
6.5高速万能粉碎机。
6.6旋转蒸发仪。
恒温水浴。
6.8微孔滤膜：0.45pm。
6.9反应管：15mL，螺口，带聚四氟乙烯衬垫。6.105mL容量瓶。
6.115 mL安瓶。
10mL具塞试管。
7．测定方法
7.1抽样
产品抽样按GB/T30891的规定进行。2
7.2试样制备
7.2.1鲜海参
去肠腺、灰嘴，剪成约0.5cm×0.5cm的小块，句浆备用。7.2.2干海参
粉碎，过0.850mm筛，混匀备用。7.2.3即食海参及盐渍海参
剪成约0.5cm×0.5cm的小块，匀浆备用。7.2.4其他海参制品
直接粉碎、勾浆或混匀，备用。7.3海参皂苷的提取
7.3.1固体样品
GB/T 33108--2016
粉末状试样称取约2g（精确至0.01g），匀浆试样称取约10g（精确至0.01g），加人40mL乙醇溶液（5.13），回流提取1h，重复提取3次，合并乙醇提取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发除去乙醇，提取物用20mL水溶解，加人20mL正丁醇，充分振荡，静置分层，吸取上层正丁醇层，按上述方法用正丁醇重复萃取3次，合并正了醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至于，即得海参皂粗提物。7.3.2液体样品
准确移取20mL～50mL样品于分液漏斗中，加人等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至干，郎得海参皂营粗提物。7.4水解
将7.3得到的粗提物溶解于2mL三氟乙酸溶液（5.15）后，转移至5mL安额瓶中，充氮封管，120℃水解2h，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（5.16）中和至pH值为6.5~7.5后转移人10mL具塞试管中，加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法重复萃取3次，将上层水相转移至5mL容量瓶中，用水定容至5mL，即得海参皂昔水解液。7.5衍生及净化
7.5.1衍生
推确移取7.4制备的试样海参皂苷水解液250uL于15mL反应管牛，加人250uLPMP衍生剂溶液（5.18）和250μL的NaOH溶液（5.17），涡旋混合混匀，70C水浴反应30min，取出冷却至室温，加250uL盐酸溶液（5.14），祸旋混合。7.5.2净化
加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45um滤膜，供高效液相色谱分析。3
GB/T 33108--2016
7.6标准工作曲线制作
准确移取浓度为6.48mg/L，12.96mg/L，19.44mg/L，25.92mg/L，32.4mg/L的诺糖标准工作液（5.20）250uL于15mL具塞反应管中，加人250uLPMP衍生剂溶液（5.18）和250uL的氢氧化钠溶液（5.17），祸旋混合混匀后，70℃水浴反应30min，取出冷却至室温，加250L盐酸溶液（5.14），涡旋混合。
加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃奔下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45μm滤膜。以喹诺糖标准工作溶液浓度为横坐标，以座诺糖衍生物峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。
空自试验
除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。7.8平行试验
对同试样进行平行试验测定。
7.9测定
液相色谱参考条件
色谱柱：Cia柱，150mm×4.6mm，5um或其他性能相当。7.9.1.1
柱溫:25 ℃。
7.9.1.3检测波长：250nm。
7.9.1.4进样量：20μL。
7.9.1.5流速：1.0mL/min。
7.9.1.6流动相：磷酸盐-乙腈溶液（5.22）。色谱分析
分别注人20μL喹诺糖系列标准衍生液（7.6）试样衍生液（7.5）和空白衍生液（7.7）于高效液相色谱仪中，按7.9.1规定的色谱条件进行分析，记录峰面积，试样液中喹诺糖衍生物的响应值均应在标准曲线范围之内。根据标准品的保留时间定性，外标法定量。喹诺糖标准溶液衍生物和试样液衍生物液相色谱图参见附录A。
7.10结果计算与表述
7.10.1试样中海参皂苷的含量（以喹诺糖计)按式(1)计算：X (cu co) × 5
式中：
（1）
试样中海参皂苷的含量（以喹诺糖计），单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；试样海参皂苷水解液中喹诺糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；-空白水解液中喹诺糖的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；试样海参皂苷水解液的定容体积，单位为毫升（mL）；试样的质量或试样体积，单位为克（g）或毫升（ml.）。计算结果保留三位有效数字。
7.10.2海参皂营与喹诺糖的换算参照附录B。8方法灵敏度、准确度和精密度
灵敏度
本方法定量限：固体样品5.0mg/kg，液体样品1.0mg/L。8.2准确度
本方法喹诺糖在固体样品中添加回收率8.3精密度
GB/T33108---2016
主液体样品中添加回收率为95%～110%。本方法批内相对标准端差≤10%，批间相对标准偏差≤15%GB/T 33108—2016
A.1噻诺糖行生物标准色谱图
座诺糖衍生物标准色谱图见图A.1mAU
A.2干海参中隆诺糖衍生物色谱图附录A
（资料性附录）
液相色谱图
喹诺糖衍生物标准色谱图
千海参中噻诺糖衍生物色谱图见图A.2mAU
干海参中隆诺糖生物色谱图
A.3海参口服液中隆诺糖衍生物色谱图海参口服液中喹诺糖衍生物色谱图见图A.3。6
海参口服液中隆诺糖行生物色谱图GB/T33108—2016
GB/T33108--2016
B.1海参皂苷的含量计算
（资料性附录）
海参皂苷与喹诺糖的换算
试样中海参皂苷的含量按式（B.1）进行计算，计算结果保留三位有效数字。X-XF
式中：
X.-试样中海参皂苷的含量，单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）-试样中喹诺糖的含量，单位为毫克每干克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；F
一喹诺糖换算为海参皂苷的系数。B.2不同品种海参中海参皂苷的换算系数不同品种海参中海参皂苷与喹诺糖的换算系数见表B.1。表B.1不同品种海参中海参皂苷与喹诺糖的换算系数海参品种
刺参(Apostichopus japonicus)革皮氏海参（Holothuria atra）黑海参（Holothuria atra）
北极海参（Holothuria mezicana）靴参(Actinopyga echinites)
糙海参（Holothunmscobra）
乌皱参(Actbmpyga miliaris）
GB/T 33108-2016
换算系数 F
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书号：155066：1-54731
定价：
9107-80188/0
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