GB/T 35939-2018
基本信息
标准号： GB/T 35939-2018
中文名称：脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 35939-2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法
GB/T35939-2018
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标雅
GB/T35939—2018
脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detecting theantibody against encephalomyocarditis virus2018-02-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：南京农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。本标准起草人：白娟、王岩、姜平、蒋康富GB/T35939—2018
1范围
脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法，GB/T35939—2018
本标准适用于猪脑心肌炎病毒抗体的检测、猪脑心肌炎血清流行病学调查和实验室诊断。注：脑心肌炎疫病简介参见附录A。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集保存与运输技术规范SN/T2984
3缩略语
检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则下列缩略语适用于本文件。
BSA：牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbentassay）EMCV：脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus）HRP-SPA：辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（Horseradishperoxidaselabeledstaphylococcalprotein A)
TMB：四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine）VPl：病毒结构蛋白1（Viralprotein1)4仪器、材料与试剂
4.1试验仪器
4.1.1酶联免疫检测仪
4.1.2高速台式冷冻离心机。
4.1.3微量移液器：
规格0.5μl10μL20μL~200μL、100μL~1000μL。4.1.412道可调微量移液器：
规格10μ～100。
4.2试验材料
96孔酶标反应板。
4.2.2注射器（5mL）。
GB/T35939—2018
4.2.3微量离心管（1.5mL）。
4.2.4吸头（可与移液器配套）。4.3主要试剂
4.3.1重组EMCVVP1抗原（制备方法见附录B中的B.1）。4.3.2EMCV阳性血清和EMCV阴性血清（制备方法见附录B.2）。4.3.3HRP-SPA。
4.3.4TMB(见附录C)。
4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒。5EMCV间接ELISA抗体检测方法
5.1样品采集、运输与保存处理
5.1.1样品要求
按NY/T541采集猪血液，按SN/T2984处理待检猪。另外，按GB19489进行检测，5.1.2样品采集与运送wwW.bzxz.Net
采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL，若无血清分离条件，待血液凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室。
5.1.3血清分离、保存与运送
取5.1.2凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清，放人无菌微量离心管中，用于抗体检测，或置一20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。要求血清清亮，无溶血。5.2ELISA操作步骤
5.2.1EMCVVP1蛋白包被板的制备：a）抗原包被：用pH9.6抗原包被液（见C.1)将纯化的重组EMCVVP1蛋白稀释成2.0μg/mL，加人96孔酶标反应板，每孔100μL，置37℃2h；b）洗涤：弃去孔中液体，加洗涤液洗涤（PBST，见C.5），每孔300uL，洗涤3次，每次3min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣磕反应板，但应避免孔壁变干；封闭：加入含5%脱脂乳粉的PBST，200uL/孔，置37℃下封闭2h；c
d）洗涤：同5.2.1b）；
加保护剂溶液：加人抗原保护剂（见C.3），100μL/孔，置37℃下作用1h；e
密封：置37℃干燥，用锡箔纸真空包装，密封。f
5.2.2加被检血清及对照血清：每份被检血清各取4μL，分别加到有196μL稀释液的微量离心管中，作1：50倍稀释。混匀后分别取100uL依次加人间接ELISA板反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清（1：50倍稀释）对照各两孔，每孔100μL。盖好包被板置37℃湿盒内孵育1h。
待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释所有待检血清，再将稀释好的血清转移到抗原包被板，尽可能使反应时间一致。5.2.3洗涤同5.2.1b）。
5.2.4加酶标记抗体和孵育：加人PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-SPA）2
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（1：3000稀释），100μL/孔，37℃孵育0.5h5.2.5洗涤同5.2.1b）。
GB/T35939—2018
5.2.6加底物缓冲液和孵育：每孔加新配制的底物溶液（见C.6）100μL.37℃避光孵育5min～15min（参见附录D）。
5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/LH,SO4溶液（见C.7），50μL/孔，终止反应5.2.8酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值，15min内完成结果判定
5.3.1结果计算
P/N计算，P/N=被检血清的两孔平均OD450值/阴性对照血清的两孔平均OD450值5.3.2判定
阳性对照血清平均OD450值≥0.5，阴性血清两孔平均OD45值≤0.2，判定试验条件成立。当P/N≥2.1，判为阳性，P/N<2.1则判为阴性或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行。3
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GB/T35939—2018
附录A
（资料性附录）
疫病简介
脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus.EMCV）引起的多种脊椎动物共患的传染病，以脑炎，心肌炎以及心肌周围炎为主要特征。猪和鼠是受感染最普遍的动物。临床上可引起存猪急性致死性心肌炎和脑炎及母猪繁殖障碍等疾病。人可呈现轻度脑炎临诊症状。1960年巴拿马首次从急性死亡猪脾脏和肺脏分离到病毒，此后，澳大利亚、南非、新西兰、古巴、加拿大、意大利、希腊、瑞土、比利时和塞浦路斯多次暴发流行，引起严重经济损失。我国于2007年在发病猪群中也发现脑心肌炎病例，并分离到病毒，但常表现为亚临床感染。本病实验室诊断方法有小鼠感染试验、病毒分离鉴定、RT-PCR方法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、血清中和试验和间接免疫荧光试验等。doc88- vuonge
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B.1重组EMCVVP1抗原制备
B.1.1菌种
附录B
（规范性附录）
抗原抗体的制备
GB/T35939—2018
表达EMCVVP1抗原蛋白的菌种为BL21-VP1，由EMCVVP1基因原核表达质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3）获得。
B.1.2菌液培养
取BL21-VP1种子液按培养基体积1%量接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min，37℃摇床振荡培养1.5h～2h，菌液浓度ODmm值达到1时，加人终浓度为07mmol/L的IPTG，ong
37℃振荡培养8h。
B.1.3重组蛋白的表达及纯化
菌液收集
增m收
将B.1.2收集的细菌样品4℃7500r/min离心1统试剂盒说明书，在变性条件下纯化重组融合蛋白EMCVPI。
重组菌裂解液的制备
集菌体，按照商品化的重组蛋白纯化系Q
具体制备过程如下：
将胍盐细胞裂解缓冲液的pH调至7.8.并于37℃预热；a)
b）100mLLB液体培养基表达的重组菌液，7000r/min离心10min，收集菌体沉淀；c)
用8mL胍盐细胞裂解缓冲液，pH7.8条件下重悬上述菌体，室温下震摇5min~10min，使菌体充分裂解；
在功率200W的条件下超声波裂解细菌，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液变得清澈，在冰盒上操作；
将上述裂解物4℃8000r/min离心10min，沉淀菌体碎片，将上清转移至新的离心管中。亲和层析柱的准备
具体准备过程如下：
检查柱子下端的帽子完好无破损；a
从4℃冰箱取出树脂小瓶，颠倒重悬树脂使均勾；c)
吸取树脂2mL注人柱中，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；加人6mL无菌去离子水，上下颠倒使树脂重悬、再自然下沉后缓缓吸出上清；d）
加入6mL结合缓冲液，上下颠倒使树脂重悬；使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；重复d)～e)2次。
变性条件下的纯化方法
具体纯化方法如下：
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GB/T35939—2018
a）将8mL菌体裂解液加人准备好的柱子中，室温下轻轻震摇15min～30min，使树脂在裂解液中充分悬浮，让蛋白与磁珠上的抗体充分结合；室温下使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；b）
c）加入4mL结合缓冲液（pH7.8)重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤2次；
d）加人4mL洗涤缓冲液（pH6.0）重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；
e）加人4mL洗脱缓冲液（pH5.3)重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；
加入5mL洗脱缓冲液（pH4.0），除掉柱子下端的帽子，使液体自然流出，每500μL1管，分f)
10管收集洗脱的蛋白。紫外分光光度计测蛋白浓度。B.1.4重组蛋白质量和性能检验
B.1.4.1蛋白纯度鉴定：取上述收集的样品20μL，加人5μL5×蛋白样品上样缓冲液，充分混勾后100℃煮沸5min，立即置冰上1min～2min，上样前瞬时离心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDSPAGE分析，电泳结果52kDa处应出现单一条清晰条带，且无其他杂带，用凝胶成像系统扫描分析其纯度，纯度不低于90%。
B.1.4.2蛋白抗原性鉴定：上述收集的样品20uL，按B.1.4.1方法进行SDS-PAGE电泳。然后25V恒压下，转印45min，使目的条带转印至NC膜上。用PBST配制的5%的脱脂乳封闭2h，PBST洗涤后，加适量稀释的EMCVVP1单克隆抗体，作用1h，PBST洗涤，再加1：20000稀释的羊抗鼠IgGHRP作用1h，洗涤后加显色液于暗室曝光，应在52kDa处出现单一条清晰条带，且无其他杂带。B.1.4.3蛋白浓度的测定：用紫外分光光度计分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的光吸收值（OD），按公式1.45×OD280mm一0.74×OD260mm计算抗原浓度，浓度不低于0.5mg/mLB.1.4.4蛋白免疫学活性鉴定：采用ELISA方法对抗原的免疫学活性进行鉴定。用抗原包被液将纯化的蛋白从1.0ug/mL稀释至0.2ug/mL，包被抗原包被板，进行ELISA检测。选择阳性血清的S/P值高于阳性判定标准时的抗原最高稀释倍数作为抗原包被浓度。抗原浓度应不低于0.20ug/mL。B.1.5分装及保存
将合格的蛋白分装到1.5mL微量离心管中，分装量为1mL/管，置一70℃下保存，有效期为12个月。避免反复冻融和污染。
B.2EMCV对照血清制备
B.2.1EMCV阳性对照血清
B.2.1.1血清来源动物：4周龄～5周龄健康EMCV抗原和抗体双阴性猪（ELISA检测血清中EMCV抗体阴性，PCR检测EMCV阴性），隔离观察7d。B.2.1.2免疫接种：取EMCVNJ08株（TCID50≥106°/mL）病毒液，颈部肌肉注射2mL/头，间隔28d用相同剂量EMCVNJ08株再次接种，二次接种后20d～40d采血分离血清，用病毒血清中和试验检测EMCV抗体，中和抗体效价≥1：32时，即可用于采血并分离血清。B.2.1.3血清制备：采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用样品稀释液适量稀释，用0.45μm滤膜过滤除菌，置一70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。6
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EMCV阴性对照血清
B.2.2.1血清来源动物：同B.2.1.1。GB/T35939—2018
2血清制备：选用上述合格仔猪，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用样品B.2.2.2
稀释液适量稀释，用0.45um滤膜过滤除菌，置一70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。
GB/T35939—2018
C.1抗原包被液（pH9.6.0.05moL/L）附录C
（规范性附录）
溶液的配制
称取NazCO1.59g、NaHCO,2.93g，加去离子水800mL，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调至pH9.6.加去离子水定容至1000mL。C.2封闭液
称取脱脂乳粉5g溶解于100mLPBST洗涤液中，0.22um滤膜过滤，分装后4℃保存。C.3
保护剂溶液
称取BSA0.5g、蔗糖2g，加去离子水溶解并定容至100mL.0.22uμm滤膜过滤，分装后2℃~8℃备用。
C.4样品稀释液
取NaCl8g.KH,PO4:2H,O0.2gNazHPO4.12H02.9g,KCl0.2g和Tween-200.5mL.溶于灭菌去离子水中，定溶至1000mL.0.22um滤膜过滤，分装，20mL/瓶。2℃～8℃下保存。C.510×PBST浓缩洗涤液（0.1molpH7.4）取NaCl80g、KH.PO4·2H,O2gNazHPO412HO29gKC12g、Tween-205mL.加人灭菌去离子水充分溶解，定容至1000mL.0.22μm滤膜过滤，分装，80mL/瓶。2℃～8℃下保存。洗涤液配制：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解（或于37℃水浴锅中加热5min～10min），然后用去离子水作10倍稀释，混勾，稀释好的洗涤液在2℃～8℃可以存放7d。C.6底物溶液
A液配制：取NazHPO.14.6g、柠檬酸9.33g、30%H,O22mL、加去离子水至1000mL，调至pH5.0~5.4;
B液配制：取3.3.5.5-四甲基联苯二胺20mg、无水乙醇10mL、加去离子水至1000mL。使用前将A液和B液等量混合，分装于棕黑色瓶内.20mL/瓶.2℃～8℃下避光保存。C.7终止液（2mol/LH2SO）
取去离子水177.8mL，缓慢加人HS0（96%）22.2mL分装，10mL/瓶，2℃8*C下保存。8
附录D
（资料性附录）
底物溶液作用时间的说明
GB/T35939—2018
底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶催化作用就慢，颜色反应则慢。因此，底物的作用时间以阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时终止反应。本标准中规定的底物作用时间5min～15min，是在不同温度条件下的大致范围。9
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脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detecting theantibody against encephalomyocarditis virus2018-02-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：南京农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。本标准起草人：白娟、王岩、姜平、蒋康富GB/T35939—2018
1范围
脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法，GB/T35939—2018
本标准适用于猪脑心肌炎病毒抗体的检测、猪脑心肌炎血清流行病学调查和实验室诊断。注：脑心肌炎疫病简介参见附录A。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集保存与运输技术规范SN/T2984
3缩略语
检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则下列缩略语适用于本文件。
BSA：牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbentassay）EMCV：脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus）HRP-SPA：辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（Horseradishperoxidaselabeledstaphylococcalprotein A)
TMB：四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine）VPl：病毒结构蛋白1（Viralprotein1)4仪器、材料与试剂
4.1试验仪器
4.1.1酶联免疫检测仪
4.1.2高速台式冷冻离心机。
4.1.3微量移液器：
规格0.5μl10μL20μL~200μL、100μL~1000μL。4.1.412道可调微量移液器：
规格10μ～100。
4.2试验材料
96孔酶标反应板。
4.2.2注射器（5mL）。
GB/T35939—2018
4.2.3微量离心管（1.5mL）。
4.2.4吸头（可与移液器配套）。4.3主要试剂
4.3.1重组EMCVVP1抗原（制备方法见附录B中的B.1）。4.3.2EMCV阳性血清和EMCV阴性血清（制备方法见附录B.2）。4.3.3HRP-SPA。
4.3.4TMB(见附录C)。
4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒。5EMCV间接ELISA抗体检测方法
5.1样品采集、运输与保存处理
5.1.1样品要求
按NY/T541采集猪血液，按SN/T2984处理待检猪。另外，按GB19489进行检测，5.1.2样品采集与运送wwW.bzxz.Net
采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL，若无血清分离条件，待血液凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室。
5.1.3血清分离、保存与运送
取5.1.2凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清，放人无菌微量离心管中，用于抗体检测，或置一20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。要求血清清亮，无溶血。5.2ELISA操作步骤
5.2.1EMCVVP1蛋白包被板的制备：a）抗原包被：用pH9.6抗原包被液（见C.1)将纯化的重组EMCVVP1蛋白稀释成2.0μg/mL，加人96孔酶标反应板，每孔100μL，置37℃2h；b）洗涤：弃去孔中液体，加洗涤液洗涤（PBST，见C.5），每孔300uL，洗涤3次，每次3min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣磕反应板，但应避免孔壁变干；封闭：加入含5%脱脂乳粉的PBST，200uL/孔，置37℃下封闭2h；c
d）洗涤：同5.2.1b）；
加保护剂溶液：加人抗原保护剂（见C.3），100μL/孔，置37℃下作用1h；e
密封：置37℃干燥，用锡箔纸真空包装，密封。f
5.2.2加被检血清及对照血清：每份被检血清各取4μL，分别加到有196μL稀释液的微量离心管中，作1：50倍稀释。混匀后分别取100uL依次加人间接ELISA板反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清（1：50倍稀释）对照各两孔，每孔100μL。盖好包被板置37℃湿盒内孵育1h。
待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释所有待检血清，再将稀释好的血清转移到抗原包被板，尽可能使反应时间一致。5.2.3洗涤同5.2.1b）。
5.2.4加酶标记抗体和孵育：加人PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-SPA）2
iiiKAoNikAca
（1：3000稀释），100μL/孔，37℃孵育0.5h5.2.5洗涤同5.2.1b）。
GB/T35939—2018
5.2.6加底物缓冲液和孵育：每孔加新配制的底物溶液（见C.6）100μL.37℃避光孵育5min～15min（参见附录D）。
5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/LH,SO4溶液（见C.7），50μL/孔，终止反应5.2.8酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值，15min内完成结果判定
5.3.1结果计算
P/N计算，P/N=被检血清的两孔平均OD450值/阴性对照血清的两孔平均OD450值5.3.2判定
阳性对照血清平均OD450值≥0.5，阴性血清两孔平均OD45值≤0.2，判定试验条件成立。当P/N≥2.1，判为阳性，P/N<2.1则判为阴性或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行。3
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GB/T35939—2018
附录A
（资料性附录）
疫病简介
脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus.EMCV）引起的多种脊椎动物共患的传染病，以脑炎，心肌炎以及心肌周围炎为主要特征。猪和鼠是受感染最普遍的动物。临床上可引起存猪急性致死性心肌炎和脑炎及母猪繁殖障碍等疾病。人可呈现轻度脑炎临诊症状。1960年巴拿马首次从急性死亡猪脾脏和肺脏分离到病毒，此后，澳大利亚、南非、新西兰、古巴、加拿大、意大利、希腊、瑞土、比利时和塞浦路斯多次暴发流行，引起严重经济损失。我国于2007年在发病猪群中也发现脑心肌炎病例，并分离到病毒，但常表现为亚临床感染。本病实验室诊断方法有小鼠感染试验、病毒分离鉴定、RT-PCR方法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、血清中和试验和间接免疫荧光试验等。doc88- vuonge
HiiKAoNiKAca
B.1重组EMCVVP1抗原制备
B.1.1菌种
附录B
（规范性附录）
抗原抗体的制备
GB/T35939—2018
表达EMCVVP1抗原蛋白的菌种为BL21-VP1，由EMCVVP1基因原核表达质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3）获得。
B.1.2菌液培养
取BL21-VP1种子液按培养基体积1%量接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min，37℃摇床振荡培养1.5h～2h，菌液浓度ODmm值达到1时，加人终浓度为07mmol/L的IPTG，ong
37℃振荡培养8h。
B.1.3重组蛋白的表达及纯化
菌液收集
增m收
将B.1.2收集的细菌样品4℃7500r/min离心1统试剂盒说明书，在变性条件下纯化重组融合蛋白EMCVPI。
重组菌裂解液的制备
集菌体，按照商品化的重组蛋白纯化系Q
具体制备过程如下：
将胍盐细胞裂解缓冲液的pH调至7.8.并于37℃预热；a)
b）100mLLB液体培养基表达的重组菌液，7000r/min离心10min，收集菌体沉淀；c)
用8mL胍盐细胞裂解缓冲液，pH7.8条件下重悬上述菌体，室温下震摇5min~10min，使菌体充分裂解；
在功率200W的条件下超声波裂解细菌，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液变得清澈，在冰盒上操作；
将上述裂解物4℃8000r/min离心10min，沉淀菌体碎片，将上清转移至新的离心管中。亲和层析柱的准备
具体准备过程如下：
检查柱子下端的帽子完好无破损；a
从4℃冰箱取出树脂小瓶，颠倒重悬树脂使均勾；c)
吸取树脂2mL注人柱中，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；加人6mL无菌去离子水，上下颠倒使树脂重悬、再自然下沉后缓缓吸出上清；d）
加入6mL结合缓冲液，上下颠倒使树脂重悬；使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；重复d)～e)2次。
变性条件下的纯化方法
具体纯化方法如下：
HiiKAoNiKAca
GB/T35939—2018
a）将8mL菌体裂解液加人准备好的柱子中，室温下轻轻震摇15min～30min，使树脂在裂解液中充分悬浮，让蛋白与磁珠上的抗体充分结合；室温下使树脂自然下沉，缓缓吸出上清；b）
c）加入4mL结合缓冲液（pH7.8)重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤2次；
d）加人4mL洗涤缓冲液（pH6.0）重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；
e）加人4mL洗脱缓冲液（pH5.3)重悬树脂，充分震摇2min，使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；
加入5mL洗脱缓冲液（pH4.0），除掉柱子下端的帽子，使液体自然流出，每500μL1管，分f)
10管收集洗脱的蛋白。紫外分光光度计测蛋白浓度。B.1.4重组蛋白质量和性能检验
B.1.4.1蛋白纯度鉴定：取上述收集的样品20μL，加人5μL5×蛋白样品上样缓冲液，充分混勾后100℃煮沸5min，立即置冰上1min～2min，上样前瞬时离心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDSPAGE分析，电泳结果52kDa处应出现单一条清晰条带，且无其他杂带，用凝胶成像系统扫描分析其纯度，纯度不低于90%。
B.1.4.2蛋白抗原性鉴定：上述收集的样品20uL，按B.1.4.1方法进行SDS-PAGE电泳。然后25V恒压下，转印45min，使目的条带转印至NC膜上。用PBST配制的5%的脱脂乳封闭2h，PBST洗涤后，加适量稀释的EMCVVP1单克隆抗体，作用1h，PBST洗涤，再加1：20000稀释的羊抗鼠IgGHRP作用1h，洗涤后加显色液于暗室曝光，应在52kDa处出现单一条清晰条带，且无其他杂带。B.1.4.3蛋白浓度的测定：用紫外分光光度计分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的光吸收值（OD），按公式1.45×OD280mm一0.74×OD260mm计算抗原浓度，浓度不低于0.5mg/mLB.1.4.4蛋白免疫学活性鉴定：采用ELISA方法对抗原的免疫学活性进行鉴定。用抗原包被液将纯化的蛋白从1.0ug/mL稀释至0.2ug/mL，包被抗原包被板，进行ELISA检测。选择阳性血清的S/P值高于阳性判定标准时的抗原最高稀释倍数作为抗原包被浓度。抗原浓度应不低于0.20ug/mL。B.1.5分装及保存
将合格的蛋白分装到1.5mL微量离心管中，分装量为1mL/管，置一70℃下保存，有效期为12个月。避免反复冻融和污染。
B.2EMCV对照血清制备
B.2.1EMCV阳性对照血清
B.2.1.1血清来源动物：4周龄～5周龄健康EMCV抗原和抗体双阴性猪（ELISA检测血清中EMCV抗体阴性，PCR检测EMCV阴性），隔离观察7d。B.2.1.2免疫接种：取EMCVNJ08株（TCID50≥106°/mL）病毒液，颈部肌肉注射2mL/头，间隔28d用相同剂量EMCVNJ08株再次接种，二次接种后20d～40d采血分离血清，用病毒血清中和试验检测EMCV抗体，中和抗体效价≥1：32时，即可用于采血并分离血清。B.2.1.3血清制备：采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用样品稀释液适量稀释，用0.45μm滤膜过滤除菌，置一70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。6
iiKANiKAca
EMCV阴性对照血清
B.2.2.1血清来源动物：同B.2.1.1。GB/T35939—2018
2血清制备：选用上述合格仔猪，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用样品B.2.2.2
稀释液适量稀释，用0.45um滤膜过滤除菌，置一70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。
GB/T35939—2018
C.1抗原包被液（pH9.6.0.05moL/L）附录C
（规范性附录）
溶液的配制
称取NazCO1.59g、NaHCO,2.93g，加去离子水800mL，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调至pH9.6.加去离子水定容至1000mL。C.2封闭液
称取脱脂乳粉5g溶解于100mLPBST洗涤液中，0.22um滤膜过滤，分装后4℃保存。C.3
保护剂溶液
称取BSA0.5g、蔗糖2g，加去离子水溶解并定容至100mL.0.22uμm滤膜过滤，分装后2℃~8℃备用。
C.4样品稀释液
取NaCl8g.KH,PO4:2H,O0.2gNazHPO4.12H02.9g,KCl0.2g和Tween-200.5mL.溶于灭菌去离子水中，定溶至1000mL.0.22um滤膜过滤，分装，20mL/瓶。2℃～8℃下保存。C.510×PBST浓缩洗涤液（0.1molpH7.4）取NaCl80g、KH.PO4·2H,O2gNazHPO412HO29gKC12g、Tween-205mL.加人灭菌去离子水充分溶解，定容至1000mL.0.22μm滤膜过滤，分装，80mL/瓶。2℃～8℃下保存。洗涤液配制：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解（或于37℃水浴锅中加热5min～10min），然后用去离子水作10倍稀释，混勾，稀释好的洗涤液在2℃～8℃可以存放7d。C.6底物溶液
A液配制：取NazHPO.14.6g、柠檬酸9.33g、30%H,O22mL、加去离子水至1000mL，调至pH5.0~5.4;
B液配制：取3.3.5.5-四甲基联苯二胺20mg、无水乙醇10mL、加去离子水至1000mL。使用前将A液和B液等量混合，分装于棕黑色瓶内.20mL/瓶.2℃～8℃下避光保存。C.7终止液（2mol/LH2SO）
取去离子水177.8mL，缓慢加人HS0（96%）22.2mL分装，10mL/瓶，2℃8*C下保存。8
附录D
（资料性附录）
底物溶液作用时间的说明
GB/T35939—2018
底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶催化作用就慢，颜色反应则慢。因此，底物的作用时间以阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时终止反应。本标准中规定的底物作用时间5min～15min，是在不同温度条件下的大致范围。9
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