标准号：SN/T 5135-2019 标准名称：布氏蜗牛检疫鉴定方法 英文名称：Detection and identification of Fruticicola fruticum (Muller, 1774) 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-03 实施时间：2020-03-01 标准大小：14413K 标准介绍：1范围 本标准规定了布氏蜗牛的检疫鉴定方法 本标准适用于布氏蜗牛的检疫鉴定 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注H期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T3067-2011软体动物常规检疫规范 3术语与定义 SN/T3067-2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 为动物内脏器官盘存之 胚螺层 embryon ic shell 贝壳最早发育的部分称为胚螺层，一般为壳顶1.5个~2个螺层，其形态有尖、钝、圆钝、扁平、乳头状，有的种类常被腐蚀磨损，但这些特征较为明显，且稳定，常用于分类。 3.3 外套膜 mantle 为陆生软体动物躯体背部皮质层皱延伸而成，是一层覆盖内脏囊的膜状物，肺血管网密布其上可行呼吸作用与分泌碳酸钙形成贝壳 矢囊 dart sack 矢囊是蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚中空的钙质或壳质骨针的肌质的。一般用长径与短径之比来描述矢囊的相对长度 阴茎鞘 Pen is sheath 包被在阴茎与阴茎本体外围的一层鞘状膜 轴唇 columella lip 贝壳壳口的边缘为口屏，按其在壳口中的位置不同可分为内、外脬、轴脬、基脣、上脬和下孱，靠近螺轴的口唇即称轴，有些种类的轴唇常外折导致脐孔部分或完全被覆盖

ICS65.020.01
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T51352019
布氏蜗牛检疫鉴定方法
Detection and identification of Fruticicola fruticum (Muller, 1774)行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T5135—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农业科学研究院生物资源研究所、中华人民共和国拉萨海关。
本标准主要起草人：周卫川、林阳武、王沛、吴宇芬、文艺、陈晟行业标准信息服务平台
1范围
布氏蜗牛检疫鉴定方法
本标准规定了布氏蜗牛的检疫鉴定方法。本标准适用于布氏蜗牛的检疫鉴定。规范性引用文件
SN/T5135—2019
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T30672011软体动物常规检疫规范3术语与定义
SN/T3067一2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
螺旋部spiral
为动物内脏器官盘存之处，通常由除体螺层外的其它几个螺层组成，3.2
embryonicshell
胚螺层
贝壳最早发育的部分称为还螺层，一般为壳顶1.5个～2个螺层，其形态有尖、钝、圆钝、扁平、乳头状，有的种类常被腐蚀磨损，但这些特为明显，且稳定，常用于分类。3.3
外套膜
mantle
信息服
为陆生软体动物驱体背部皮质层皱褶延伸而成是一层声内脏囊的膜状物，肺血管网密布其上，可行呼吸作用与分泌碳酸钙形成贝壳3.4
矢囊dartsack
矢囊是蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚中空的钙质或壳质骨针的服质的囊。一般用长径与短径之比来描述失囊的相对长度。3.5Www.bzxZ.net
penissheath
阴茎鞘
包被在阴茎与阴茎本体外围的一层鞘状膜3.6
轴唇columellalip
贝壳壳口的边缘为口唇，按其在壳口中的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、基唇、上唇和下唇，靠近螺轴的口唇即称轴唇，有些种类的轴唇常外折导致脐孔部分或完全被覆盖1
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4基本信息
学名：Fruticicolafruticum（Muller，1774）。异名：Helixfruticum，Muller，1774；Bradybaenafruticum（Muller，1774)。英文名：Bushsnail。
中文名：布氏蜗牛。
分类地位：软体动物门（Mollusca），腹足纲（Gastropoda），肺螺亚纲（Pulmonata），柄眼目（Stylcmmatopgora），巴蜗牛科（BradybaenidaePilsbry，1934），布氏蜗牛属（FruticicolaHeld，1838）。布氏蜗牛属只有2个种，即布氏蜗牛和史氏蜗牛Fruticicolaschrenkii（Middendorff，1851）。布氏蜗牛的其他信息参见附录A。
5方法原理
生态习性和传播方式及途径是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态和软体解部是实验室鉴定的主要依据，分子特征作为不具备形态学鉴定样品的鉴定依据。器具和试剂
6.1仪器和用具
仪器：体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、PCR仪、凝胶照相系统。用具：放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、塘瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、小剪刀、显微镀子、显微剪刀、微针（直径0.15mm）、解剖蜡盘、标签、1.5mL离心管、宁业标准
0.2mLPCR反应管、移液枪。
6.2试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。信息服
乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCPMasterMix、ddH,O。7
现场检疫
对来自疫区（参见附录A）的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输主具、废塑料、木质包装箱、苗木、水果、蔬菜、花卉、未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着其上，尤其要注意阴敲光处的检查，用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹。布氏蜗牛爬行过后，一般都会留下银灰色的丝带状粘液痕魅，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛，随时装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或幼螺。8
实验室鉴定
8.1测量、观察、解剖和饲养
用游标卡尺测量贝壳的壳高和壳宽、卵粒的直径或长和宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵、贝壳和螺体的形态特征。2
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将闷杀处理（参见10.1）后的标本，按照SN/T3067一2011中8.3.1进行软体解剖，分离出生殖系统。
单独查获的卵粒，按照SN/T3067一2011中8.4方法，将其孵化和饲养为成螺后，再做鉴定。8.2布氏蜗牛属FruticicolaHeld，1838鉴定特征贝壳呈扁圆球形至透镜形，壳质稍厚。体螺层膨大，圆形，壳面白色至栗色，具有稠密的生长线和细螺纹。体螺层周缘常有颜色较深的色带，有些个体则无色带。壳口形状随贝壳形状而变，近圆形至牵角状，适度倾斜。生殖系统无鞭状体。该属和巴蜗牛属BradybaenaBeck，1837的主要区别是阴茎较长，内有刺激器，而巴蜗牛属则阴茎较短，无刺激器8.3布氏蜗牛鉴定特征
卵粒圆形，白色，直径1.5mm左右。8.3.2贝壳
8.3.2.1成螺
贝壳呈扁圆球形，壳质稍厚，坚实。5个～6个螺层，缝合线深，各螺层膨胀、外凸，胚螺层表面光滑，螺旋部粗糙。贝壳透明，活体一般透过贝壳可见黑色小点或斑纹，为外套膜色彩。壳面色泽变异较大，以淡黄色为主，有时呈红棕色甚至紫罗兰色，周缘具有色带或无色带。脐孔开放且深，略被轴唇遮盖，其直径约是壳宽的1/7。体螺层膨大，圆形，具有稠密的生长线和细螺纹。壳口简单，近圆形，适度向下倾斜。外唇内侧增厚，形成较厚的环唇肋。壳高10mm～20mm.壳宽13mm～25mm。（参见附录B中图B.1、图B.2）
8.3.2.2幼螺
幼螺贝壳较小，壳质薄，透明，易碎形态特征与成螺贝壳基本一致。标岭
8.3.3螺体
动物软体多为浅色，透过贝壳可以看到外套膜的态，其工黑点和暗色斑块的特征更为明显。触角颜色比腹足稍深。（参见附录B中图B.3）8.3.4生殖系统
输精管十分细长，其长度约为阴茎的2倍多，与阴茎本体末端相连。例茎长部布满纵向或者横向倾斜的直或者弯曲的折叠，未端部分沿着浅槽缩小，无圆锥形的边缘结构。阴茎基部具美鞘。阴茎牵引肌与阴茎本体相连，较短。阴道卵圆形或长椭圆形，矢囊短小，圆锥形，有副矢囊。粘液腺2枝或多枝，气泡状至圆管状。受精囊柄基部膨大，后渐变细，受精囊大（参见附录B中图B.4)。8.3.5COI基因序列鉴定
按照附录C方法提取DNA、PCR扩增和双向测序，将所测序列与Genbank登录号为AY546264.1已知布氏蜗牛的COI基因标准序列进行比对，相似度≥95%的待鉴样品确认为布民蜗牛的疑似样品。（参见附录C)
8.3.6近似种鉴别特征比较
布氏蜗牛与近似种史氏蜗牛的主要鉴别特征列于附录D。3
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9结果评定
以贝壳形态为基本鉴定依据，结合螺体形态和生殖系统解部形态特征，对手于贝壳特征典型的个体符合8.3.2鉴定为布氏蜗牛，对于贝壳特征有变异的个体，需同时符合8.3.2、8.3.3和8.3.4才能鉴定为布氏蜗牛。不具备形态鉴定的卵粒、幼螺等样品，用COI基因进行序列鉴定（参见附录C），当待测样品的DNA序列与已知标准样品的DNA序列同源性95%时，确定为布氏蜗牛的疑似样品，需要通过饲养或孵化和伺养（参见SN/T3067中8.4饲养鉴定）为成螺后，再做进一步的形态鉴定。10标本处理和保存
10.1标本处理
将蜗牛置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，进行闷杀，蜗牛在慢慢室息的死亡过程中，逐渐伸展身体；或逐渐加人少量硫酸镁，快速进行麻醉问杀。将闷杀后的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡1d～2d，然后在75%的乙醇溶液中固定，每隔1d～2d换1次乙醇溶液，共换3次～4次，便可长期保存于75%的乙醇溶液中。解后的生殖系统可直接保存于75%的乙醇溶液中。
10.2保存时间
经鉴定处理后的布氏蜗牛标本应永久保存，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。行业标准信息服务平台
A.1寄主
附录A
（资料性附录）
布氏蜗牛的寄主、地理分布及其他信息SN/T5135—2019
杂食性，以各种绿色植物为食。幼螺以腐植质、植物的幼苗和嫩芽为食；成螺取食各种绿色植物的茎、叶和果实，尤其喜食蔬菜和花卉等园艺作物。在野外也发现该蜗牛常取食蘑菇等菌类。A.2地理分布
欧洲的大部分国家，包括奥地利、保加利亚、捷克共和国、德国、英国、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士和乌克兰。传人地区：不列颠群岛的东南部。A.3生物学与危害性
布氏蜗牛对恶劣环境的抗性强，为广布性种类，广泛分布于欧洲地区，危害当地的园艺作物，并传播人畜共患寄生虫病，对环境卫生也造成影响。布氏蜗牛对干旱敏感，喜生活在温暖潮湿的地方，特别是高大的绿色植被下面。在瑞士和保加利亚，布氏蜗牛可生活在海拨1800m的高山，但高于1500m的山地种群密度较低。在希腊北部，成螺在初夏季节产卵，秋季活动频繁，冬季休眠，来年春天又开始活动。生长一年后壳宽为10mm，二年后20mm，三年后可达25mm。该蜗半一般在温暖潮湿的三月～八月可多次产卵，每次产卵10粒～30粒，25d～50d后孵化出幼螺力螺在月～八月快速生长，约一年半至两年后性成熟。成螺寿命可标准信息服务平台
达六年之久。
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附录B
（资料性附录）
布氏蜗牛形态特征
FB.1战螺贝壳形态特征
（A：侧面观B背面C：腹面观）
息服务平
成螺贝壳色泽和色带的变异
图B.3螺体形态特征（引自https：//en.wikipedia.org/）SN/T5135—2019
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图B.4生殖系统形态特征（仿Schileyko，2004）PS
（MG：粘液腺；P：阴茎；PS：阴茎鞘：PR：阴茎牵引肌；S：矢囊：AS：副矢囊；PBC.受精囊柄；Be.受精囊：VD：输精管：HD：两性管：AG：蛋白腺Sti：刺激器）业标准信息服务平台
C.1DNA提取
附录C
（资料性附录）
布氏蜗牛COI基因鉴定方法
取适量腹足肌肉，用SDS方法或动物基因组DNA试剂盒方法提取DNA。C.2COI基因引物
LCO1490:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3HCO2198：5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3C.3反应体系
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反应体系为20μL：其中DNA模板2μL，LCO1490（10um）0.5μLHCO2198（10μm）0.5μL2XMasterMix10μL，ddHO7μL。C.4PCR扩增条件
94℃5min；94℃50s45℃30s，72℃50s，30~35个循环；72℃10min，4℃C.5测序
C.6比对鉴定
将双向测序获得的600bp～700bp长度的DNA序列片段，经软件拼和人工校对后，与Genbank努平台
登录号为AY546264.1已知布氏蜗牛COI基因的标准序列进行比对，相伤度≥95%的待鉴样品确定为布氏蜗牛的疑似样品。
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螺层数
壳高×壳宽
附录D
（资料性附录）
布氏蜗牛与近似种的鉴别
表D.1布氏蜗牛同属物种鉴别特征的比较布氏蜗牛
F.fruticum(Muller,1774)
5个～6个
圆球形
淡黄色为主，色泽变异较大·透明明显的白色内环唇肋
10mm~20mm×13mm~25mm
广泛分布于欧洲
史氏蜗牛
F,schrenkii (Middendorff.1851)4.5个~5个
凸透镜形
窄小，部分被轴缘覆盖
角白色，色泽变异小，不透明或轻微半透明弱的白色内环唇肋
9mm~14mm×14mm~18mm
俄罗斯西北部局部地区
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