标准号：SN/T 4877.15-2019 【高清版】
标准名称：基因条形码筛查方法 第15部分：检疫性叶点霉
英文名称：DNA barcoding screening method---Part 15 Quarantine Phyllosticta spp
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：5631K
标准介绍：SN/T4877基因条形码筛查方法》分为15个部分：
一第1部分：检疫性棒形杆菌；
一第2部分：检疫性黄单胞菌；
一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
一第5部分：检疫性拟茎点霉
一第6部分：检疫性嗜酸菌；
一第7部分：检疫性轮枝菌；
一第8部分：检疫性炭疽菌；
一第9部分：检疫性腥黑粉菌；
一第10部分：检疫性疫霉；
一第11部分：检疫性异株苋亚属；
一第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒；
一第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
一第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒
一第15部分：检疫性叶点霉。
本部分为SNT4877的第15部分。
本部分依据GB/T1.1-2009给出的规则起草
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分规定了检疫性叶点霉DNA条形码筛查方法
本部分适用于进境植物及其产品中检疫性叶点霉的筛查
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T2589植物病原真菌检测规范
3术语和定
下列术语和定义适用于本文件。
3.1检疫性叶点霉属真菌
葡萄苦腐病菌 Greeneria nicola(Berk,etM.A. Curtis) Punit halingam(现用名为 Ph yllosticta an
felicia( Engelm.)Aa,曾用名 Guignardia bidwellii(lil) Viala8. Ravan和 Phoma uvicola berk.8.MA. Curtis)。分类地位：叶点霉属( Phyllosticta)、球壳孢科( Phyllostictaceae)、葡萄座腔菌目( botryosphaerias)、座囊菌纲( Dothideom vcetes)、子囊菌门( Ascomycota)

ICS65.020.01
i ii acJoUak?
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.15—2019
基因条形码筛查方法
第15部分：检疫性叶点霉
DNA barcoding screening method-Part 15:Quarantine Phyllosticta spp.2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分：一第1部分：检疫性棒形杆菌；
一一第2部分：检疫性黄单胞菌；一一第3部分：检疫性植原体；
一一第4部分：检疫性茎点霉；
一一第5部分：检疫性拟茎点霉；一一第6部分：检疫性嗜酸菌；
一一第7部分：检疫性轮枝菌；
一一第8部分：检疫性炭疽菌；
一一第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉；
一第11部分：检疫性异株宽亚属；第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒；第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒：第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒；第15部分：检疫性叶点霉。
本部分为SN/T4877的第15部分。本部分依据GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T4877.15—2019
本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：段维军、蔡磊、郭立新、陈倩、段丽君、李雪莲、刘芳、赵文军、陈先锋。1范围
基因条形码筛查方法
第15部分：检疫性叶点霉
本部分规定了检疫性叶点霉DNA条形码筛查方法本部分适用于进境植物及其产品中检疫性叶点霉的筛查。2规范性引用文件
SN/T4877.15—2019
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2589植物病原真菌检测规范3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1检疫性叶点霉属真菌
葡萄苦腐病菌Greeneriauuicola（Berk.etM.A.Curtis）Punithalingam（现用名为Phyllostictaampelicida（Engelm.)Aa，曾用名Guignardiabidwellii（Ellis)Viala&Ravaz和Phoma uvicolaBerk.&M.A.Curtis）。分类地位：叶点霉属（Phyllosticta）、球壳孢科（Phyllostictaceae）、葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、子囊菌门（Ascomycota）3.2凭证标本（Voucherspecimen）凭证标本是一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存需要有详细的标本编号、存放地点等详细信息，以便于日后查证。3.3DNA条形码（DNAbarcode）
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。研究人员用DNA条形码技术鉴定物种及物种间亲缘关系，修改已有的分类学结论等。用于鉴定检疫性叶点霉属的DNA条形码如下：核糖体基因转录间隔区（InternalTranscribedSpacer，简称ITS）4方法原理
根据叶点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)的序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性叶点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性叶点霉及其种属归类。1
SN/T4877.15—2019
5仪器用具和试剂
5.1仪器设备与用具
显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μL，2.5μL.10μL，20μL，200μL，1000μL）、带规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪。5.2主要试剂
购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（Na,EDTA·2HO）、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI）、漠化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、冰酷酸（CH,COOH）、蒸馏水、氯仿（CHCI）、异戊醇、7O%乙醇。PCR和电泳检测所需试剂：1OXPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq聚合酶、引物、超纯水、DL2000Marker、琼脂糖、GelRed核酸凝胶染料。6筛查鉴定方法
6.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养参照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。6.2核酸的制备
采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。6.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50×OD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7～1.9。6.4序列扩增测序
利用通用引物对ITS基因进行扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中叶点霉属ITS基因序列相似性均大于98%，则比对分析序列同源性。
7结果判定
ITS基因序列长度大于500bp·在NCBI数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中叶点霉属ITS基因序列（参见附录C）同源性大于98%，则判定该菌为叶点霉属。
若测定序列与附录D检疫性叶点霉ITS参考序列同源性为100%，则判定该菌为葡萄苦腐病菌。2
8保存
8.1样品保存
SN/T4877.15—2019
分离并最终鉴定为检疫性目标真菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存.定期（30d～60d)转接，必要时冻干后长期保存。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件3
SN/T4877.15—2019
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法
A.1取适量菌丝体（500mg）和灭菌的玻璃珠放在2mL离心管中，加入500μL2XCTAB（60℃），置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温30～60min，偶尔震荡混勾；A.2加人500μL（1：1，等体积）氯仿/异戊醇（24：1），混合均匀后（3min），12000rpm，离心15min；A.3提取上清液，加人250μL（1：1，等体积）氯仿/异戊醇（24：1），12000rpm，离心15min；重复此步骤一次；
A.4提取上清液，加入等体积异丙醇，混匀，沉淀30minA.5出现沉淀后，12000rpm离心10min；A.6弃去液相.加人400μL70%乙醇，震荡洗涤，再12000rpm离心5min；重复此步骤一次A.7弃去液相，超净工作台中干燥DNA，约20min;A.8加人50或100uL双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于一20℃保存备用4
目标基因
附录B
（规范性附录）
PCR扩增方法
引物序列
扩增引物
ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC
dNTP混合物（各10mmol/mL）
10XPCR缓冲液（含Mg+）
正向引物
反向引物
Tag酶
DNA模板
预变性
PCR反应体系（以25μL为例）
PCR反应程序（适用基因ITS）
反应温度（℃）
SN/T4877.15—2019
扩增片段
体积（μL）
循环数
SN/T4877.15—2019
物种名称
Botryosphaeria obtusa
Guignardia gaultheriae
G.mangiferae
Phyllosticta aloeicola
P.ampelicida(syn.
Greeneria uvicola)
P.beaumarisii
P.bifrenariae
P.brazilianiae
P.capitalensis
P.carochlae
P.citriasiana
P.citribraziliensis
P.citricarpa
P.citrichinaensis
P.citrimarima
P.concentrica
P.cordylinophila
P.cussoniae
P.ericarun
P.eugeniae
P.foliorum
P.hubeiensis
附录C
（资料性附录）
叶点霉属真菌参考序列的GenBank登录号（ITS）表C.1
叶点霉属真菌参考序列的GenBank登录号（ITS）菌株编号！
CMW8232
CBS447.70
IMI260.576
CPC21020
CPC21023
ATCC200578*
CBS535.87=IMI
VIC30556-CBS
LGMF330 = CBS
CPC 18848 = CBS
CPC16592
CBS123405
CPC20274*
CGMCC3.17317*
CGMCC3.17318=
CBS120486
CBS100098
CBS127454
CPC16603
ZJUCC200956
CPC20276= CBS
CBS937.70
CPC20261*
CPC14873=CBS
CBS 132534 = CPC
CBS445.82
CBS447.68
CGMCC3.14355
CGMCC 3.14986
Conifers
Gaultheria humif
Mangtfera indica
Aloe feror
Aloe ferox
Vitis riparia
Vitis winifera
Vitis vinifera
Muehlenbeckia
Bifrenaria harrisoniae
Mangifera indica
Stanhopea sp,
Citrus limon
Musa acutminata
Mangifera indica
Caryota ochlandra
Caryota ochlandra
Citrus marima
Citrus limon
Citrus limon
Citrus limon
Citrus reticulata
Citrus marima
Hedera helia
Cordyline fruticosa
Cussonia sp.
Ericagracilis
Eugenia aromatica
Tarus baccata
Hosta plantaginea
Viburnum
采集地
SouthAfrica
South Africa
SouthAfrica
France
France
Australia
Brazil
Brazil
Brazil
Argentina
Thailand
Thailand
Thailand
Brazil
Australia
Uruguay
Thailand
Thailand
South Africa
SouthAfrica
Indonesia
Netherlands
ITSGenBank登录号
AY972105
JN692543
JF261459
KF154280
KF154283
KC193586
HM008728
HM008727
AY042927
JF343565
JF343572
JF261465
KF206187
FJ538334
KF170305
KJ847422
KJ847423
FJ538360
FJ538352
JF343583
KF170295
JN791620
KF170304
FJ538350
KF170287
JF343578
KF206170
AY042926
KF170309
IN692535
JX025037
物种名称
P.hymenocallidicola
P.hypoglossi
P.ilicis-aqutfolit
P.ouaniana
P.parthenocissi
P.parlricuspidatae
P.paristimae
P.pohiloprina
P.podocarpi
P.podocarpicola
P.pseudotsugae
P.schimae
P. schimicola
P.spinarum
P.styracicola
P.telopeae
P.vaccini
P.vaccinicola
P.vitis-rotundifoliae
菌株编号
CBS131309
CBS434.92
CGMCC 3.14358
CBS585.84*
CBS776.97
CBS111645
NBRC9466*=
NBRC 9757=
CBS112527
CBS616.72
CBS111647
CBS728.79
CBS111649
CGMCC 3.14354
CGMCC3.17319*
CGMCC3.17320=
CBS292.90
CGMCC 3.14985*
CGMCC 3.14989
CBS777.97
ATCC46255
CPC18590*
CGMCC3.17321=
CBS117136
(续）
Hymenocallis littoralis
Ruscus aculeatus
ilexaquifolium
Acer rubrumwww.bzxz.net
Brabejum stellatifolium
Parthenocissus
Parthenocissus
Parthenocissus
Paristima myrsinites
Ileraquifolium
Podocarpus lanceolata
Podocarpus maki
Pseudotsuga menziesii
Schima superba
Schima superba
Schima superba
Chamaecyparispisifera
Styrar grandiflorus
Styrar grandiflorus
Telopea speciosissima
Vaccinium macrocarpon
Vaccinium
Vitis rotundifolia
Vitis rotundifolia
Yucca elephantipes
采集地
Australia
SouthAfrica
Germany
South Africa
France
Tasmania
NewZealand
SN/T4877.152019
ITSGenBank登录号
JQ044423
FJ538367
JN692538
KF206176
FJ538368
EU683672
KJ847424
KJ847425
KF206172
KF154279
KF154276
KF206173
KF154277
JN692534
KJ847426
KJ847427
JF343585
JX025040
JX025041
KF206205
KC193585
KF170312
KJ847429
KJ847428
JN692541
菌种保藏中心CBS:CulturecollectionoftheCentraalbureauvoorSchimmelcultures，FungalBiodiversityCentre，Utrecht,TheNetherlands; IMl:Culture collection of CABI Europe UK Centre, Egham,UK; ATCC:American TypeCulture Collection,Manassas,VA,USA; CPC:Working collection of Pedro W.Crous,housed at CBS,the Netherlands;CGMCC:China General Microbial Culture Collection;LC:Working collection of Lei Cai,housed at CAS,China;VIC: Culture collection of Federal University of Viccosa, Vicosa,Brazil; ZJUCC: Zhejiang University CultureCollection,China;NBRC:Biological Resource Center,theNational Institute of Technology,and Evaluation.Japan.模式菌株用星号*标注。
SN/T4877.15—2019
附录D
（规范性附录）
检疫性叶点霉ITS参考序列
葡萄苦腐病菌Phyllostictaampelicida（来自于模式菌株ATCC200578，KC193586）CTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAAACTAGTAATTTCTTCTTGAATGGATCGAGTAGGGCGGCCCTGAAAAGCCGTCCGAAAGAGCCCTTCTCACCCCTGTGTACCTTACCATGTTGCTTTGGCGGGCCGACCCGGTTTCGACCCGGGCGGCCGGCGCCCCCAGCCCCTCGCGGGCCAGGACGCCCGGCCAAGCGCCCGCCAGTATACAAAACTCAAGCGATTATTTCGTGAAGTCCTGACATATCATTCAATTGATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGCATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGCGACGTCCGCCGTCGGACGCGCCTCGAAGACCTCGGCGACGGCGTCTCGGCCTCGAGCGTAGTAGTAACATCTCGCTTTGGAGCGCTGGGCGACGGCCGCCGGACAATCGACCCCGCGGTCTGTTACATCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA8
参考文献
SN/T4877.15—2019
Wikee S,Lombard L.Nakashima C,Motohashi K, Chukeatirote E,Cheewangkoon R,McKenzie EHC,Hyde
KD,CrousPW.2o13.A phylogenetic re-evaluation of Phyllosticta(Botryosphaeriales).StudiesinMycology76:1-29
Zhang K,Zhang N,Cai L.2o13.Typification and phylogenetic study of Phyllosticta ampelicidaandP.zaccinii.Mycologia105：1030-1042.Zhou N, Chen Q,Carroll G, Zhang N,Shivas RG, Cai L,2ol5.Polyphasic characterization offour new plant pathogenicPhyllosticta species from China,Japan,and the United States.Fungal Biology119：433-446.
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