本标准规定了用目标序列测序法测定植物转基因成分的方法。 本标准适用于植物及其产品中的外源基因和转基因品系的定性检测。本方法外源基因的定性检出低限(LOD)为0.1%(外源基因与内标准基因间的拷贝数比)。

ICS07.080
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中华人民共和国国家标准
GB/T38570—2020
植物转基因成分测定
目标序列测序法
Delermination for ingredients of genetically modified plants-Target sequencing methods
2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
规范性引用文件
术语和定义
试剂或材料
仪器设备
测定步骤
抽样和制样
DNA提取与纯化.
文库构建
高通量测序
8质量控制
结果分析与表述
结果分析
结果表述
10防污染措施
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
探针序列
人工DNA
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GB/T38570—2020
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。iiiKAa~cJouaAa
GB/T38570—2020
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。木文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准山中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：江汉大学、武汉明了生物科技有限公司、中国标准化研究院、北京工商大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所、湖南杂交水稍研究中心、深圳华大智造科技有限公司。本标准主要起草人，彭沟，陈利红，方治伟，张嘉楠，李甜甜，李论、崔野韩、马爱进，贾英民，陈红，周俊飞、翟文学、许娜、梁勇、高利芬、宋书锋、胡美霞、符习勤、张静、余进文。iiikAa~cJouakAa
1范围
植物转基因成分测定
自标序列测序法
本标准规定了用目标序列测序法测定植物转基因成分的方法。iiiKAa~cJouaKA
GB/T38570-—2020
本标准适用于植物及其产品中的外源基因和转基因品系的定性检测。本方法外源基因的定性检出低限(LOD)为0.1%（外源基因与内标准基因间的考贝数比）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5-2018转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
内标准基因endogenous referencegene在植物不同物种中普遍存在且拷贝数恒定的基因。3.2
exogenous genebzxz.net
外源基因
利用生物工程技术转人的使生物品种表现新的生物学性状的其他生物基因。3.3
质控样品controlsample
与待测样品平行制样，用于显示待测样品在制样过程中是否被污染的样品。3.4
template fragment
模板片段
由高通量测序片段中一组具有相同随机条形码的测序片段推测的一条模板脱氧核糖核酸（DNA）序列。
外源基因特征片段characteristic fragment of exogenous gene包含了外源基因但在自然界中不有在的模板片段。注：包括含有人工改造序列的外源基因序列，以及外源基因与除外源基因在起源物种中的边界序列以外的序列相连接的序列。
GB/T38570--2020
4原理
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通过抽样与制样获得待测样品与质控样品·提取并片段化样品基因组DNA、连接接头序列、PCR扩增连接产物、探针捕获扩增产物、扩增捕获产物获得测序文库，高通量测序、分析测序数据和进行质量控制并得出检测结论。
本方法通过不同的样品条形码识别并控制实验室气溶胶污染：通过外源基因特征片段识别外源基因并区分微生物污染：通过与多种转基因元件匹配的杂交探针同时检测多种转基因成分。5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂5.1水：GB/T6682
5.2文库构建试剂
5.3高通量测序式剂盒
5.4探针序列见附豪A。
5.5人工DNA序：见附蒙B
6仪器设备
高通量测序仪。
7测定步聚
抽样和制样
待测格品抽美与制样
按GB/T1495.中规定的方法执行。7.1.2质控样品制样
从待测样品制样开始创结束的封程中，把1g/μL的人工DNA的溶暴露于制样环境中，作为质控样品。
7.2DNA提取与纯化
按GB/T19495.3的方法或具有相同效果的基因组DNA提取试剂盒提取并纯化待测样品和质控样品DNA。
7.3文库构建
7.3.1概述
利用文库构建试剂盒及其操作说明进行文库构建。7.3.2DNA片段化
利用酶切消化或机械破碎的方法，将待测样品和质控样品基因组DNA片段化至100bp~1000bp。2
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GB/T38570--2020
片段化时，基因组DNA的最低加人量参照GB/T19495.5—2018中附录B中规定的定量下限为0.1%时的DNA模板最低加入量。
7.3.3末端修复与接头连接
对7.3.2中获得的产物进行末端修复并连接接头序列。接头序列应包括三个部分：约20个碱基的通用序列，8个碱基组成的随机条形码序列和12个碱基的样品条形码序列。其中，不同的持测样品或质控样品使用不同的样品条形码序列，且在同一个实验室中相同的样品条形码序列在30天内，只使用一次。按试剂盒说明纯化连接产物。7.3.4PCR扩增
利用7.3.3中接头上的通用序列设计引物对7.3.3中获得的产物进行扩增，扩增循环数小于或等于15个。其中，所设计的引物序列包含高通量测序仪的测序引物序列。按试剂盒说明纯化扩增产物将具有不同样品条形码的待测样品或质控样品等质量混合后成为混合样品，每个混合样品中待测样品或质控样品的数目不宜超过4个。7.3.5杂交捕获
将附录A中的探针按等率尔质量混合，形成混合探针，利用混合探针对7.3.4中获得的产物进行案交捕获。按试剂盒说明纯化捕获产物。7.3.6PCR扩增
利用高通量测序仪的测序引物序列对7.3.5中的产物进行扩增，扩增循环数小于或等于20个，获得测序文库。按试剂盒说明纯化测序文库。7.4高通量测序
利用高通量测序试剂盒及其操作说明对测序文库进行高通量测序，每个待测样品的测序碱基数据量设置为大于或等于1G.
8质量控制
利用转基因鉴定软件对获得的测序数据进行质量控制，并输出质量控制结论。质量控制程序要求如下：
当质量控制结论为制样过程中存在交叉污染时，从7,1开始重新实验。a）
b）当质量控制结论为模板片段数量不足时，加大基因组DNA用量后从7.3或之前的步骤开始重新实验
当质量控制结论为文库构建失败时，从7.3或之前的步骤开始重新实验。d）当质量控制结论为测序数据量不足时，从7.4或之前的步骤开始重新实验。e）当质量控制结论为测序数据质量合格时，进行结果分析。结果分析与表述
9.1结果分析
利用多位点多核苷酸多态性（MLMNP）转基因鉴定软件计算待测样品中外源基因特征片段的数目(TEF)。
GB/T38570—2020
结果表述
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当TEF<3时，表述为\未检出×X外源基因（或XX转基因品系）”。当TEF≥3时，表述为“检出××外源基因（或×X转基因品系）”。9.2.2
对于无法有效提取DNA的样品，表述为“未检出核酸成分”。9.2.3
防污染措施
7.17.3.2的测定步骤的防污染措施按GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。A.1
外源基因探针序列见表A,1~表A.28。表A1
附景A
（规范性附录）
探针序列
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花椰菜花叶病毒的35S启动子（pCaMV35S）探针序列探序列（从5端到3端）
GACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTCCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGATAACAGCACAGTTGCTCCTCTCAGAGCAGAATCGGGTATTCAACACCCTCATATCAACTACTACGTTGTGTATAACGGTCCACATGCCGGTATATACGATGACTGGGGTIGTACAAAGGCGGCAACAAACGGCGTTCCCGGAGTTGCACACAAGAAATTTGCCACTATTACAGAGGCAAGAGCAGCAGCTGACGCGTACACAACAAGTCAGCAAACAGACAGGTTGAACTTCATCCCCAAAGGAGAAGCTCAACTCAAGCCCAAGAGCTTIGCTAAGGCCCTAACAAGCCCACCAAAGCAAAAAGCCCACTGGCTCACGCTAGGAACCAAAAGGCCCAGCAGTGATCCAGCCCCAAAAGAGACTCCTTTGCCCCGGAGATTACAATGGACGATTTCCTCTATCTTTACGATCTAGGAAGGAAGTTCGAAGGTGAAGGTGACGACACTATGTTCACCACTGATAATGAGAAGGTTAGCCTCTTCAATTTCAGAAAGAATGCTGACCCACAGATGGTTAGAGAGGCCTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGTAACAATCTCCAGGAGATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAATTGCATCAAGAACACAGAGAAAGACATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCATAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCTACTGAATCTAAGGCCATGCATGGAGTCTAAGATTCAAATCGAGGATCTAACAGAACTCGCCGTGAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTTTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGATAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATCCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTICGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACCCTGAAATCACCAGB/T38570—2020
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花椰菜花叶病毒终止子（t35S）探针序列探针序列（从5端到3端）
CGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGACCATATAAGATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATGCTTCTATCAAT表A.3
3玄参花叶病毒的35S启动子（pFMV35S）探针序列探针序列（从5端到3端）
GTCGTCACTGCGTTCGTCATACGCATTAGTGAGTGGGCTGTCAGGACAGCTCTTTTCCACGTTATTTTGTTCCUCACTTGTACTAGAGGAATCTGCTTTATCTTTGCAATAAAGGCAAAGATGCTTTTGGTAGGTGCGCCTAACAATTCTGCACCATTCCTTTTTTGTCTGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGATGTTGACAAGATTACTTTCAAAGATGCCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTGGATGTCTTTTTCTGAAACTTACTGACCATGATGCATGTGCTGGAACAGTAGTTTACTTTGATTGAAGATTCTTCATTGATCTCCTGTAGCTTTTGGCTAATGGTTTGGAGACTCTGTACCCTGACCTTGTTGAGGCTTTGGACTGAGAATTCTTCCTTACAAACCTTTGAGGATGGGAGTTCCTTCTTGGTTTTGGCGATACCAATTTGAATAAAGTGATATGGCTCGTACCTTGTTGATTGAACCCAATCTGGAATGCTGCTAAATATTTTGATGAATATAGCTGCATCTTTTGCATTTAAAACCTTTTTTCGAAAGTTTTTAATTGCTTTAACAATTCCTTCTGGGAACCATTTTAGTTCCTGTAGGTTAGGACTCGGATAGATGACCTTGGCTAATCCTGCTCGGAATGCTGTGTGAACCAGATAAGGTTCTGCGTTTTCAACAAAAGTGTATGTACTTTTGCTTGCTGAATCGTTGGTGTAGAACTTTTCTTGTACACCATCTTCAAGATCTGAAAGTCTTGATTTTICCCATATCTGACGAAACTCATCAAATTGTATGGTTTGTTCTGCTCCAATGGCCTTGAACTTCAATGGCTGTGCTGCTCTTTCTTCTTTGACTAGTTTGACTGGTCTTAGAAAATTTACTGGGTCTTGGATGTCTTTGTTGTAAAGACTGATAGACACTTCAGCTTGCTCCTTTGATCGGAATCT表A.4农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子（pNOS）探针序列探针序列（从5端到3端）
AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGATTGAAGGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGATTGAAGGAGCCACTCAGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCCACTGACGTTCCATAA编号
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GB/T38570—2020
5农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（tNOS）探针序列表A.5
探针序列（从5到3端）
CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCCCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTAC6新霉素磷酸转移酶基因（NPTI）探针序列表A.6
探针序列（从5端到3端）
ATGGATGGTGAAGATGTTCAAGCTGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGITUCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGQCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACTCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCAGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAACGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA表A.7潮霉素碟酸转移酶基因(HPT)探针序列探针序列（从5'端到3端）
ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAACTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCXGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGA7
GB/T38570-—2020
表A7（续）
探针序列（从5端到3端）
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CAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTACAACCGGTCGCGGAGGCTATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTACCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGCGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCCAPTOOOOCAACAATGTCCTGACGGATCCAACAATGTCCTCAEGGACAATGCCEGEATAACAGCGCTCATGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAAACGACCEEGCCAACATCTTCTTCTGCGCCGTGOTTGGCTTCTGGAGCCGTGOTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTCGAGGAGGCATCCGGAGC
TTGCAG
CACGACTCOCGGCGTATATCCTCCGCATTCGTCTTOCCAATTGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGTGATGCAGCTTGGGCGCA GGT GATECGACLCAATCUTCGATUPGOAGECCGGACTGTUGCGCGT CAOIGTOGGGCGTAC
ACAAATXCCAOAAGCUOECTIUACCGATGGTGTTAGAAGTAICGC GATAGTGGLAAICEACFCCCCAGEACTGTCCMGECAAAGAAATAGC
P葡萄糖苷酸海因（GUS
探针房列05墙到3端
GTCCTGTAGAAACOCAACCCOTGAC
TCAAAAAACTGOACGGLCTCTGGCATCA TCTGGATCGCGAAAACTGTO
GAATTGATCAGCITGGRGOGAAAGCGCGTTACAAGAAGCCCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATTTCTAATTATGCG
GGCAA GTCT
GTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGCCAGCCAC
GTATCGTOTGCG TTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGTC
ATAATCAGGAAGTG
ATGGAGCATCAGGGCGOCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTOTACGTATOACCUNMTOTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGAOGAAAACGGCAAGAAAAACCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGG
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