GB/T 40253-2021
基本信息
标准号： GB/T 40253-2021
中文名称：牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：6964482
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 40253-2021.Code of diagnosis for mikrocytosis of oysters-Microscopic methods.
1范围
GB/T 40253规定了牡蛎小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求.针对主要病原马可尼小胞虫(Mikrocytos mackimi),给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备,样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40253适用于牡蛎感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断;以及牡蛎感染马可尼小胞虫的流行病学调查和诊断;其他贝类可参照执行。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件;不注8期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SC/T 7205.1-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法
SC/T 7209.3-2007牡蛎小胞虫病诊断规程第3部分:透射电镜诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DAFA:藏维森氏乙醇福尔马林-乙酸固定液(davidson' s alcohol-formalin-acetic acid fixative)
5试剂或材料
5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和燕馏水或去离子水或相当纯度的水。
5.2苏木素。
5.3碘酸钠 。
5.4钾明矾。
5.5柠檬酸。
5.6水合三氯乙醛。
5.7伊红 Y(水溶性)。
1范围
GB/T 40253规定了牡蛎小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求.针对主要病原马可尼小胞虫(Mikrocytos mackimi),给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备,样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40253适用于牡蛎感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断;以及牡蛎感染马可尼小胞虫的流行病学调查和诊断;其他贝类可参照执行。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件.仅该日期对应的版本适用于本文件;不注8期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SC/T 7205.1-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法
SC/T 7209.3-2007牡蛎小胞虫病诊断规程第3部分:透射电镜诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DAFA:藏维森氏乙醇福尔马林-乙酸固定液(davidson' s alcohol-formalin-acetic acid fixative)
5试剂或材料
5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和燕馏水或去离子水或相当纯度的水。
5.2苏木素。
5.3碘酸钠 。
5.4钾明矾。
5.5柠檬酸。
5.6水合三氯乙醛。
5.7伊红 Y(水溶性)。
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标准内容
ICS 65.020.30
CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40253—2021
牡蛎小胞虫病诊断规程
显微镜检查组织法
Code of diagnosis for mikrocytosis of oysters-Microscopic methods2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T-40253—2021
本文件按照GB/T1.1
2020%标准化工作导则
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草：
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标雅化技术委员会（SAC/C156)H。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推总站。本文件士要起草人：白吕明、杨冰、工崇明、黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠。I
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1范围
GB/T-40253—2021
显微镜检查组织法
牡蛎小胞虫病诊断规程
本文件规定了牡蛎小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的求.针对主要病原马可尼小胞虫（Mierocvtos machini），给出了织印片检测法和织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备样品、试验步骤和结果定。
本文件适用于牡蛎感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断；以及牡蛎感染马可尼小胞虫的流行病学调查和诊断；其他贝类可参照执行，规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注期的引用文件，仅该口期对应的版本适用于本文件：不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SC/T 7205.1
牡蜥他纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法SC/T7209.32007牡蛎小咆虫病诊断规程第3部分：透别电镜诊断法3
术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语
下列缩略语适用丁本文件。
DAFA：载继森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液（davidsonsalcohol-formalin-aceticacidfixative）试剂或材料
除非刃有说明.在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或大离了水或相当纯度的水。苏木素，
碘酸钠，
钾明矾，
柠檬酸。
水合一氯乙醛。
伊红Y(水溶性）。
焰红B(水溶性）。
石蜡（熔点52℃～54℃）：切片级。中性树胶：生物染色用，
甲醇。
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GB/T40253—2021
一甲苯，
水乙醇。
95%乙醇。
中醛（37%)
冰醋酸。
古姆萨（Gimesa)染液
过滤海水：经纱网（200日)过滤的海水，DAFA固定液：按附录A的A.I配制。迈尔-班尼特苏木精（Mayer-BenneltHetatoxylin)染色液：按A,2配制。伊红焰红染色液：按A.3配制。
85%乙醇：接A.4配制，
80%乙醇：按A.5配制，
75%乙.醇：接A.6配制，
70%乙醇：按A.7配制，
50%乙醇：接A.8配制。
仪器设备
显微镜：配备高倍镜（40×）和油镜（100×）石蜡切片机：满足1m~7μm厚度的石蜡连续切片要求。展片水浴锅。
烘片机，
恒温箱。
7样品
采样对象
牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类2采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.12007附录B的要求。海水温度低于10℃时为采样的最时期。
样品的采集
稚贝（附着后~2mm）和幼贝（2mm~30mm)联内旺团；成贝（30 mm)取闭壳肌和外套膜，8试验步骤
组织印片检测法
8.1.1.印片制作
用解剖刀将样本剖开，用吸水纸轻轻吸去剖面过多的黏液.随后将剖面在载玻片上印迹.制成印片.自然干燥后滴加中醇覆盖印片部分，固定5min--7mil。空气干燥。2
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8.1.2染色
8.1.2.1将干燥的印片移人吉姆萨染液中染色，染色时间约30rmin，8.1.2.2用缓慢的自来水流或洗瓶冲洗，去除多余染液。8.1.2.3室温晾干。
8.1.3封片
滴加2滴中性树胶，封片。
8.1.4观察
GB/T-40253—2021
用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野，油镜下观察出体特征。马可尼小胞虫呈卵圆形，古径2m-4 um(参见附录B),
8.2组织病理检测法
8.2.1切片制作
8.2.1.1脱水
将组织块依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中，流程如下：75%乙醇（1h45min）→85%乙醇(1 h 45 rmin)→85%乙婷(1 h 45 min)→95%乙醇(45 tmin)→95%乙醇(45 min)→无水乙醇(45 min)→无水乙醇(45 min）
8.2.1.2透明
脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇：二甲芸(1：1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下：无水乙醇：二中苯(1 1)(25 min)→二中苯(20 min)→二中苯(20 mim)。8.2.1.3浸蜡
恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下：透明后的组织块依次浸入两个盛有融化石蜡的烧杯巾各 80min
8.2.1.4包埋
在恒温箱（温度调节至高丁石蜡熔点)中熔蜡，将熔蜡倒人包埋盆』包埋模具（也叫用折叠纸盒），用预温的镊了迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具·置于冰上使其冷却凝固、8.2.1.5切片
用蜡铲或刀片将包理块四周修平.使上下两面修成平行面，保留组织周围附者宽2mm～3mtn的石蜡，用石蜡切片机切片，臣度5um。对每个石蜡包埋块至少切收两张不连续的划片，8.2.1.6展片
将切片平效丁展片机或水浴锅水面上.待仲展平整后.用载玻片捞出，置丁烘片机上或烘箱内，45℃烘片2h。
8.2.2染色
将切片放在坡片架上，依次浸人盛有不同溶液的烧杯中，流程如下：二甲苯（5 min）→二甲茶3
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GB/T40253—2021
(5min）无小乙醇（2min）无水乙醇（2min）95%乙醇(2min）95%乙醇（2min）→80%乙醇(2min）80%乙醇（2min）50%乙醇（2min）)蒸留水（2min）-→蒸馅水（2min)蒸馅水（2min）→过尔-班尼特苏木精染色液（5mim)→缓慢流动的自米水（6mi)-→伊红-焰红染色液（2min）→5%乙醇(1 min 20 s）-95%乙醇(2min）无水乙醇(2min）元水乙醇(2min）苯(2 min 30 s）甲苯(2min 30 s)→二甲苯(2 min30 s)8.2.3封片
滴加2滴中性树胶,封片。
8.2.4观察
用显微镜低倍镜搜索不同的视野油镜下放大1000倍·在泡状结缔组织利闭壳肌血细胞浸消区及其周围观察虫休特征（参见附录B)。9结果判定
9.1组织印片检测法
在油镜下观察到球形或卵圆形，直径2um~4m的出体（参见附录B)，细胞质呈蓝色或浅蓝色：细跑核早红色（闪使用商品化染色产品不同，品色略有差异），则纽织印片检测结果为阳性，判定为疑似小胞虫感染，
9.2组织病理检测法
9.2.1在马可尼小胞出病流行区域的已知易感宿主中（参见附录C)，油镜下在池状结缔组织细胞和/或肌纤维细胞细胞质中观察到球形或卵圆形、直径2 nm1nm的胞体（参见附录B).则组织病埋检测结果为阳性，判定为马可尼小胞虫感染9.2.2在其他种类宿主巾，或者在马可尼小胞虫病流行区域以外，组织病理检测结果为阳性，则判定为疑似马可尼小跑虫感染，
3疑似马可尼小胞虫感染的确诊
织印片检测法或组织病理检测法检测结果为阳性.同时原位杂交检测或按SC/T7209.3—2007透射电镜诊断法检测结果阳性，则判定为马可尼小胞出感染。4
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A.1DAFA固定液
95%乙醇
甲醛（37%）
冰醋酸
过滤海水
混勾，室温密封贮存
迈尔-班尼特苏木精染色液
水(50 °C~-60 T)
苏木素
碘酸钢
钾明矾
柠檬酸
水合三氯乙醛
（规范性）
试剂配方
1 000 ml.
按上述顺序泥合，济解后即可使用，室温存。3伊红-焰红染色液
伊红Y(水溶性）
焰红B(水溶性）
95%乙醇
冰醋酸
混句后即可使用，室温存。
85%乙醇
95%乙醇
加水定容率
混匀，室温贮存，
80%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混句，室温贮存。
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GB/T-40253—2021
GB/T 40253—2021
75%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混勾，空温贮存。
70%乙醇
95%乙醇
加水容至
混勾，空温贮存。
50%乙醇
95%乙醇
加水定穿至
混匀，宰温存
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组织印片检测法
附录B
(资料性）
显微镜检查组织法观察马可尼小胞虫形态图组织印片检测法示例见图B.1。
Ifreme
说明：
粗箭头示血细跑内马可尼小胞虫，细箭头示细胞外马可尼小脆虫。20 μum
GB/T40253—2021
图B.1马可尼小胞虫感染长牡蛎（Crassosireagigas）闭壳肌泡状结缔组织2组织病理检测法
组织病理检测法示例见图B.2
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GB/T40253—2021
箭头示结缔纠织细胞内马可尼小胞虫，亢径2μm~4μm。图B.2马可尼小胞虫感染长牡蛎消化腺泡状结缔组织-riKaeerkca-
附录C
（资料性）
牡蛎小胞虫病及其病原简介
GB/T-40253—2021
牡蛎小胞虫病主要是由马可尼小跑虫（Mikrocuosmurckini)感染牡蛎等双克贝类，引起结缔组织血细胞没润、组织环死，逃而导效闭壳肌、外套膜等部位的泡状结缔红织产生水泡、膝肿、渍疡和个体死亡的疫病。患病严重的牡蛎(2年以上成贝）外套膜具有肉眼可见的脓肿利溃疡，脓肿由颗粒细胞和透明细咆纠成,并包含有2um1um的小胞虫体，山于该病最早发现丁加拿大的丹名岛（DcnmanIs-land），因此通常被称作丹名岛病（DenmanIslandDisease）。最初发现该寄牛虫主要感架长牡蛎（Crassoslreugigu）.随后在美国加利福尼业州沿岸的熊木牡蛎（C.ikumea)中检测到该寄生虫。20止纪60年代，位丁低潮线处较大牡蛎（3年以上成贝）的死亡率可达40%左右：温度低丁10℃和高盐度可以促使本病暴发。世界动物卫生组织（OIE)水生动物卫生法典（2016版）将起该病发生的主要病原（马可尼小胞虫)列为需通报的贝奖动物病原，马可尼小胞虫病主要发生在加拿人的四南海岸，其分布遍及加拿人多个地区：在美国加利福尼亚和华盛顿州也发现有马可尼小胞虫感梁案例；自加享人出口剑法国的欧洲牡蛎中曾检测到马可尼小胞虫。从我国黄海北部长牡蛎中检测到一种低感染率的小胞虫木定种（Miroc3tosp.；该种小胞虫序列与马可尼小胞出的和似度为89%。虽然日前我国尚无马可尼小胞出的感架案例.随若近年米我国从马可尼小抱虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益哪多，该病对我国贝奖养殖业构成潜在威胁。马可尼小胞虫的宿主范围非常广泛·除天然宿主外，在人「感染条件下，该寄生虫叮以感染欧洲牡蛎（Oxtrea edulis）、奥林匹亚牡蛎（O.turida一O.romchaphia）和美洲牡蛎（C.irginica）等，日前已知象拔蚌（Panopeabrupta）和非律宾蛤仔（Venerupiphilippinarum）对马可尼小胞虫感染具有抗性。
马可尼小胞出的生长发育主要包括三个阶段：休眠期(quiescentslage)，襄泡期（vesicular stage)利内体期（cndosomalstage）：休眠期的小胞虫又称为休限细胞（quicscentcells.QC)，主要分布于囊状结缔组织、血淋巴细胞以及闭壳肌和心肌细胞。QC有：个细胞核，核内具颗粒状染色质，胞质内有高尔基体和囊泡体（图C.1)。囊泡期的小胞虫义称为囊泡细胞（vesicularcells，VC).仪在肌细胞内及其周边（细胞外）被观察到：Vc内细胞核增大为一个池腔（cisternalchamber）.膜结构的高尔基体消失，胞质内散布人小不等囊泡体（lv)（图C.2）。内体期小胞出义称为内体细胞（endosomalcell，Ec).分布于血淋也纠胞内或纠胞外和囊状结缔纽织.但肌细跑内及周边观察不到EC，EC整体形状与QC非常相似但VC胞质内细胞器史加多样，主要有速状厚影体(stb），吻合内质网（aER)（图C.3)。-riKacerKAca-
GB/T40253—2021
标引序号说明：免费标准下载网bzxz
比例尺：500nm
类高尔基体（Golgi-like:riscrnae)；类溶酶体(lysoscmr-likehodly);囊泡体（lergevesieles)：
核（nucleus）
图（.1休眠期小胞虫
标序号说明：
标引序号说明：
比例尺：500mm
吻合内质网(anaxtnmosing cndoplasmir retiemum）类溶酶体(lysosume-like body)囊泡休（largevesicles）：
核(nucleus）
比例尺：500nm
吻合内质网（anastonosingcndoplaxmieretirulh:n）：有被囊泡（eoetedvesicles）：类内休（endosome-likebodies）：美高尔其体(Golgi like cisternae);粒物(granularmatrial)：
米济酶体（lysosonnr-likhody)；毫泡体（lergevesieles）：
核(nucleus)：
球状厚壁体(sphericalthick-walledbodics)；高尔基体微管泡结均（Golgi-likttunlovtsiilar图C.3
内体期小胞虫
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囊泡期小胞虫
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CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40253—2021
牡蛎小胞虫病诊断规程
显微镜检查组织法
Code of diagnosis for mikrocytosis of oysters-Microscopic methods2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T-40253—2021
本文件按照GB/T1.1
2020%标准化工作导则
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草：
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标雅化技术委员会（SAC/C156)H。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推总站。本文件士要起草人：白吕明、杨冰、工崇明、黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠。I
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1范围
GB/T-40253—2021
显微镜检查组织法
牡蛎小胞虫病诊断规程
本文件规定了牡蛎小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的求.针对主要病原马可尼小胞虫（Mierocvtos machini），给出了织印片检测法和织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备样品、试验步骤和结果定。
本文件适用于牡蛎感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断；以及牡蛎感染马可尼小胞虫的流行病学调查和诊断；其他贝类可参照执行，规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注期的引用文件，仅该口期对应的版本适用于本文件：不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SC/T 7205.1
牡蜥他纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法SC/T7209.32007牡蛎小咆虫病诊断规程第3部分：透别电镜诊断法3
术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语
下列缩略语适用丁本文件。
DAFA：载继森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液（davidsonsalcohol-formalin-aceticacidfixative）试剂或材料
除非刃有说明.在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或大离了水或相当纯度的水。苏木素，
碘酸钠，
钾明矾，
柠檬酸。
水合一氯乙醛。
伊红Y(水溶性）。
焰红B(水溶性）。
石蜡（熔点52℃～54℃）：切片级。中性树胶：生物染色用，
甲醇。
-rrKaeerkAca-
GB/T40253—2021
一甲苯，
水乙醇。
95%乙醇。
中醛（37%)
冰醋酸。
古姆萨（Gimesa)染液
过滤海水：经纱网（200日)过滤的海水，DAFA固定液：按附录A的A.I配制。迈尔-班尼特苏木精（Mayer-BenneltHetatoxylin)染色液：按A,2配制。伊红焰红染色液：按A.3配制。
85%乙醇：接A.4配制，
80%乙醇：按A.5配制，
75%乙.醇：接A.6配制，
70%乙醇：按A.7配制，
50%乙醇：接A.8配制。
仪器设备
显微镜：配备高倍镜（40×）和油镜（100×）石蜡切片机：满足1m~7μm厚度的石蜡连续切片要求。展片水浴锅。
烘片机，
恒温箱。
7样品
采样对象
牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类2采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.12007附录B的要求。海水温度低于10℃时为采样的最时期。
样品的采集
稚贝（附着后~2mm）和幼贝（2mm~30mm)联内旺团；成贝（30 mm)取闭壳肌和外套膜，8试验步骤
组织印片检测法
8.1.1.印片制作
用解剖刀将样本剖开，用吸水纸轻轻吸去剖面过多的黏液.随后将剖面在载玻片上印迹.制成印片.自然干燥后滴加中醇覆盖印片部分，固定5min--7mil。空气干燥。2
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8.1.2染色
8.1.2.1将干燥的印片移人吉姆萨染液中染色，染色时间约30rmin，8.1.2.2用缓慢的自来水流或洗瓶冲洗，去除多余染液。8.1.2.3室温晾干。
8.1.3封片
滴加2滴中性树胶，封片。
8.1.4观察
GB/T-40253—2021
用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野，油镜下观察出体特征。马可尼小胞虫呈卵圆形，古径2m-4 um(参见附录B),
8.2组织病理检测法
8.2.1切片制作
8.2.1.1脱水
将组织块依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中，流程如下：75%乙醇（1h45min）→85%乙醇(1 h 45 rmin)→85%乙婷(1 h 45 min)→95%乙醇(45 tmin)→95%乙醇(45 min)→无水乙醇(45 min)→无水乙醇(45 min）
8.2.1.2透明
脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇：二甲芸(1：1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下：无水乙醇：二中苯(1 1)(25 min)→二中苯(20 min)→二中苯(20 mim)。8.2.1.3浸蜡
恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下：透明后的组织块依次浸入两个盛有融化石蜡的烧杯巾各 80min
8.2.1.4包埋
在恒温箱（温度调节至高丁石蜡熔点)中熔蜡，将熔蜡倒人包埋盆』包埋模具（也叫用折叠纸盒），用预温的镊了迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具·置于冰上使其冷却凝固、8.2.1.5切片
用蜡铲或刀片将包理块四周修平.使上下两面修成平行面，保留组织周围附者宽2mm～3mtn的石蜡，用石蜡切片机切片，臣度5um。对每个石蜡包埋块至少切收两张不连续的划片，8.2.1.6展片
将切片平效丁展片机或水浴锅水面上.待仲展平整后.用载玻片捞出，置丁烘片机上或烘箱内，45℃烘片2h。
8.2.2染色
将切片放在坡片架上，依次浸人盛有不同溶液的烧杯中，流程如下：二甲苯（5 min）→二甲茶3
-rrKaeerKAca-
GB/T40253—2021
(5min）无小乙醇（2min）无水乙醇（2min）95%乙醇(2min）95%乙醇（2min）→80%乙醇(2min）80%乙醇（2min）50%乙醇（2min）)蒸留水（2min）-→蒸馅水（2min)蒸馅水（2min）→过尔-班尼特苏木精染色液（5mim)→缓慢流动的自米水（6mi)-→伊红-焰红染色液（2min）→5%乙醇(1 min 20 s）-95%乙醇(2min）无水乙醇(2min）元水乙醇(2min）苯(2 min 30 s）甲苯(2min 30 s)→二甲苯(2 min30 s)8.2.3封片
滴加2滴中性树胶,封片。
8.2.4观察
用显微镜低倍镜搜索不同的视野油镜下放大1000倍·在泡状结缔组织利闭壳肌血细胞浸消区及其周围观察虫休特征（参见附录B)。9结果判定
9.1组织印片检测法
在油镜下观察到球形或卵圆形，直径2um~4m的出体（参见附录B)，细胞质呈蓝色或浅蓝色：细跑核早红色（闪使用商品化染色产品不同，品色略有差异），则纽织印片检测结果为阳性，判定为疑似小胞虫感染，
9.2组织病理检测法
9.2.1在马可尼小胞出病流行区域的已知易感宿主中（参见附录C)，油镜下在池状结缔组织细胞和/或肌纤维细胞细胞质中观察到球形或卵圆形、直径2 nm1nm的胞体（参见附录B).则组织病埋检测结果为阳性，判定为马可尼小胞虫感染9.2.2在其他种类宿主巾，或者在马可尼小胞虫病流行区域以外，组织病理检测结果为阳性，则判定为疑似马可尼小跑虫感染，
3疑似马可尼小胞虫感染的确诊
织印片检测法或组织病理检测法检测结果为阳性.同时原位杂交检测或按SC/T7209.3—2007透射电镜诊断法检测结果阳性，则判定为马可尼小胞出感染。4
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A.1DAFA固定液
95%乙醇
甲醛（37%）
冰醋酸
过滤海水
混勾，室温密封贮存
迈尔-班尼特苏木精染色液
水(50 °C~-60 T)
苏木素
碘酸钢
钾明矾
柠檬酸
水合三氯乙醛
（规范性）
试剂配方
1 000 ml.
按上述顺序泥合，济解后即可使用，室温存。3伊红-焰红染色液
伊红Y(水溶性）
焰红B(水溶性）
95%乙醇
冰醋酸
混句后即可使用，室温存。
85%乙醇
95%乙醇
加水定容率
混匀，室温贮存，
80%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混句，室温贮存。
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GB/T-40253—2021
GB/T 40253—2021
75%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混勾，空温贮存。
70%乙醇
95%乙醇
加水容至
混勾，空温贮存。
50%乙醇
95%乙醇
加水定穿至
混匀，宰温存
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组织印片检测法
附录B
(资料性）
显微镜检查组织法观察马可尼小胞虫形态图组织印片检测法示例见图B.1。
Ifreme
说明：
粗箭头示血细跑内马可尼小胞虫，细箭头示细胞外马可尼小脆虫。20 μum
GB/T40253—2021
图B.1马可尼小胞虫感染长牡蛎（Crassosireagigas）闭壳肌泡状结缔组织2组织病理检测法
组织病理检测法示例见图B.2
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GB/T40253—2021
箭头示结缔纠织细胞内马可尼小胞虫，亢径2μm~4μm。图B.2马可尼小胞虫感染长牡蛎消化腺泡状结缔组织-riKaeerkca-
附录C
（资料性）
牡蛎小胞虫病及其病原简介
GB/T-40253—2021
牡蛎小胞虫病主要是由马可尼小跑虫（Mikrocuosmurckini)感染牡蛎等双克贝类，引起结缔组织血细胞没润、组织环死，逃而导效闭壳肌、外套膜等部位的泡状结缔红织产生水泡、膝肿、渍疡和个体死亡的疫病。患病严重的牡蛎(2年以上成贝）外套膜具有肉眼可见的脓肿利溃疡，脓肿由颗粒细胞和透明细咆纠成,并包含有2um1um的小胞虫体，山于该病最早发现丁加拿大的丹名岛（DcnmanIs-land），因此通常被称作丹名岛病（DenmanIslandDisease）。最初发现该寄牛虫主要感架长牡蛎（Crassoslreugigu）.随后在美国加利福尼业州沿岸的熊木牡蛎（C.ikumea)中检测到该寄生虫。20止纪60年代，位丁低潮线处较大牡蛎（3年以上成贝）的死亡率可达40%左右：温度低丁10℃和高盐度可以促使本病暴发。世界动物卫生组织（OIE)水生动物卫生法典（2016版）将起该病发生的主要病原（马可尼小胞虫)列为需通报的贝奖动物病原，马可尼小胞虫病主要发生在加拿人的四南海岸，其分布遍及加拿人多个地区：在美国加利福尼亚和华盛顿州也发现有马可尼小胞虫感梁案例；自加享人出口剑法国的欧洲牡蛎中曾检测到马可尼小胞虫。从我国黄海北部长牡蛎中检测到一种低感染率的小胞虫木定种（Miroc3tosp.；该种小胞虫序列与马可尼小胞出的和似度为89%。虽然日前我国尚无马可尼小胞出的感架案例.随若近年米我国从马可尼小抱虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益哪多，该病对我国贝奖养殖业构成潜在威胁。马可尼小胞虫的宿主范围非常广泛·除天然宿主外，在人「感染条件下，该寄生虫叮以感染欧洲牡蛎（Oxtrea edulis）、奥林匹亚牡蛎（O.turida一O.romchaphia）和美洲牡蛎（C.irginica）等，日前已知象拔蚌（Panopeabrupta）和非律宾蛤仔（Venerupiphilippinarum）对马可尼小胞虫感染具有抗性。
马可尼小胞出的生长发育主要包括三个阶段：休眠期(quiescentslage)，襄泡期（vesicular stage)利内体期（cndosomalstage）：休眠期的小胞虫又称为休限细胞（quicscentcells.QC)，主要分布于囊状结缔组织、血淋巴细胞以及闭壳肌和心肌细胞。QC有：个细胞核，核内具颗粒状染色质，胞质内有高尔基体和囊泡体（图C.1)。囊泡期的小胞虫义称为囊泡细胞（vesicularcells，VC).仪在肌细胞内及其周边（细胞外）被观察到：Vc内细胞核增大为一个池腔（cisternalchamber）.膜结构的高尔基体消失，胞质内散布人小不等囊泡体（lv)（图C.2）。内体期小胞出义称为内体细胞（endosomalcell，Ec).分布于血淋也纠胞内或纠胞外和囊状结缔纽织.但肌细跑内及周边观察不到EC，EC整体形状与QC非常相似但VC胞质内细胞器史加多样，主要有速状厚影体(stb），吻合内质网（aER)（图C.3)。-riKacerKAca-
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标引序号说明：免费标准下载网bzxz
比例尺：500nm
类高尔基体（Golgi-like:riscrnae)；类溶酶体(lysoscmr-likehodly);囊泡体（lergevesieles)：
核（nucleus）
图（.1休眠期小胞虫
标序号说明：
标引序号说明：
比例尺：500mm
吻合内质网(anaxtnmosing cndoplasmir retiemum）类溶酶体(lysosume-like body)囊泡休（largevesicles）：
核(nucleus）
比例尺：500nm
吻合内质网（anastonosingcndoplaxmieretirulh:n）：有被囊泡（eoetedvesicles）：类内休（endosome-likebodies）：美高尔其体(Golgi like cisternae);粒物(granularmatrial)：
米济酶体（lysosonnr-likhody)；毫泡体（lergevesieles）：
核(nucleus)：
球状厚壁体(sphericalthick-walledbodics)；高尔基体微管泡结均（Golgi-likttunlovtsiilar图C.3
内体期小胞虫
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囊泡期小胞虫
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