GB/T 40257-2021
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GB/T 40257-2021.Code of diagnosis for infection with taura syndrome virus-RT-PCR method.
1范围
GB/T 40257规定了桃拉综合征诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求,针对桃拉综合征病毒( taura syndrome virus, TSV),给出了RT-PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40257适用于对虾各生活期样品中TSV带毒情况的定性检测,以进行桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28630.4-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对( base pair)
cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementary DNA)
DEPC:焦碳酸二乙酯( diethy pyrocarbonate)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy- ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙锭(ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
M-MLV :莫洛尼鼠白血病病毒( moloney- murine leukemin virus)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
RNA:核糖核酸( ribonucleic acid)
1范围
GB/T 40257规定了桃拉综合征诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求,针对桃拉综合征病毒( taura syndrome virus, TSV),给出了RT-PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40257适用于对虾各生活期样品中TSV带毒情况的定性检测,以进行桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
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GB/T 28630.4-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
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bp:碱基对( base pair)
cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementary DNA)
DEPC:焦碳酸二乙酯( diethy pyrocarbonate)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy- ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙锭(ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
M-MLV :莫洛尼鼠白血病病毒( moloney- murine leukemin virus)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
RNA:核糖核酸( ribonucleic acid)
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标准内容
ICS65.020.30
CCS B 41
中华人民共和国国家标准www.bzxz.net
GB/T40257—2021
桃拉综合征诊断规程
RT-PCR检测法
Code of diagnosis for infection with taura Syndrome virus-RT-PCR method2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T 40257—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出，本文件由全国水产标准化技术委员会（SA/T156）归口本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：万晓媛、杨冰、黄健、李清、史成银、张锋、宋晓冷、余卫忠、张庆利、李晨、许华、刘莉。
rrKaeerkAca-
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1范围
桃拉综合征诊断规程RT-PCR检测法GB/T40257—2021
本文件规定了桃拉综合征诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对桃拉综合征病毒（taurasyndromevirus，TSV），给出了RT-PcR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定：
本文件适用于对虾各生活期样品中TSV带毒情况的定性检测.以进行桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本支件。
GB/T28630.4—2012白斑综合征（WSD)诊断规程：第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩咯语适用于本文件，
bp：碱基对(basepair）
cDNA：互补脱氧核核酸（complementaryDNA）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyPyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleicacid)dNTPs：脱氙核糖核苷三磷酸（dcoxy-rihonucleosidetriphosphatc）EB：浪化乙锭（eihidiunbromide）EDTA:乙胺四乙酸(ethylenediamineletraacetic acid)MMLV：莫洛尼鼠血病病毒（moloneymurineleukeminvirus）PCR：聚合酶链式反成（polymerascchainrcaction）RNA·核糖核酸(ribonuclcic acid)RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polytnerasechain reaction）Tuq：水生栖热菌（thermus aquaticus)Tris:三羟甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane)TsV：桃拉综合征病毒（taurasyndromevirus）1
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GB/T40257—2021
5试剂或材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.2DEPC 处理水:生化试剂
TRIzolTV总R.VA提取试剂：生化试剂.或其他等效产品。氯伤。
兄丙醇。
无水乙醇
无RNA酶的75%乙醇:按附录A巾A,1配制，5.8
RNA酶抑制剂(RNasin或 RNase Inhibitor,40 L/uL).牛化试剂，一20 C保存。5.9
M-MI.V逆转录酶（200U/rl.）：生化试剂，一20℃保存，5.105X.M-MLV逆转录酶缓冲液：生化试剂，一20℃保存。5.11VTPs（各1ommol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物20℃保存.用于逆转录。
5.12dVTPs(各 2.5 mmol/L)：生化试剂，含 dATP、dTTPdGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物20℃保存.用于PCR，
5.1310×PCR缓冲液：生化试剂，无Mg-离了，-20℃保存：5.14MgCl(25 mmol/L):生化试剂.—20℃保存5.15TaqDNA聚合酶（5L/μL)：生化试剂，—20℃保存5.16I物9992F(10μmol/L)+5AAGTAGACAGCCGCGCTT35.17引物 9195R(10 mol/L):5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-35.18RT-PCR检测阳性对照：已知受TSV感染HRT-PCR结果显示阳性的对虾组织样品：一80℃保存。
5.19RTPCR检测阴性对照：已知未受TSV感染ⅡRTPCR结果显示阴性的对虾组织样品，一80℃保存，
RT-PCR检测空白对照:DEPC处理水，5.20
5.2150×电泳缓冲液：按A.2配制。5.221X电泳缓冲液：按A.3配制。5.23琼脂糖：生化试剂
5.24DVA分子量标准：生化试剂，5.25
6×载截样缓冲液：生化战剂：
10mg/mLEB贮存液：按A.4配制，或其他等效产品。6仪器设备
6.1 PCR仪
6.2电泳仪。
6.3水平电泳槽。
紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速冷冻离心机
水浴锅或金属浴。
普通冰箱。
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6.8-80℃超低温冰箱、
6.9电炉或微波炉等其他加热设备。GB/T40257—2021
6.10微量移液器：量程0.510、2~2020μ200100~10007样品
7.1采样对象
凡纳滨刘虾（Litopenaeusuanmamei）和细角滨对虾（L，stylirostris）等易感刘虾。参见附录B.7.2
采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合（13/128630,42012中附录[3的要求7.3样品的采集
7.3.1对虾仔虾取完整个体：幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸甲（淋巴器官、鳃丝、触角腺等）和附肢，
7.3.2分子生物学检测时，存虾或未达到0.5样品川以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测：所取样品分别置于1.5mI.无RVA酶离心管中，立.即进行RNA提取操作或加入相应体积TRIzolTM总RNA提取试剂,暂时保存于一20℃8试验步骤
8.1RNA的提取
8.1.1取30mg~-50mg样品.加l人0.5mL1mLTRIzolm总RNA提取试剂.研磨，室温放置5min4，【2000r/min离心5min，取「清至新的无RVA酶离心管中。提取过程同时设置即性对照和阴性对照。
8.1.2川入1/5体积的氯仿，混合至溶液乳化呈乳色，室温放置5min8.1.34℃.12000r/min离心15min。仔细吸取1层水相.移至新的无RVA酶离心管中。8.1.4加入等体积的异内醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。8.1.54 ,12 000 r/min离心10 min,弃1清。8.1.6加人1mL无RNA酶的75%乙醇（4℃预冷），上下颠倒洗涤沉淀，再丁4℃,7000r/min离心5min.小心弃上清：空温晾十沉淀8.1.7加人20μL～100μL.DEPC处理水溶解沉淀.立即用于RT-PCR或保存于一80备用。8.2RT-PCR操作
8.2.1配制逆转录引物预混液休系，分装为5l/管.使每反应管含4l.IDEPC处理水、1l10μmol/L可引物9195R.保存于—20℃，临用前，川人1μL（质量浓度：1ng/μL~1000ng/μL）待测RNA样品。70C顶变性10min后，即刻放人冰浴中冷却2min，同时设置以DEPC处理水为模板的空白对照
8.2.2配制逆转录酶预混物，配制方法为：2L.5×M-VIV逆转录酶缓冲液、0.5I.dNTPs（各10 mmol/L),0.25 μL RNase Inhibitor(40 U/μL),0.5 L M-MLV逆转录酶(200 U/μL),加 0.75 μLDEPC处埋水补足至4μL，混勺后，川至8.2.1中的样品管.稍离心，置于42℃水浴锅或金属浴巾反成1h，70℃15min后.可获得cDNA模板3
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GB/T 40257—2021
8.2.3PCR反应体系：按照表1的要求，配制成除TagDVA聚合酶以外的大体积预混物，分装保存于20℃，临用前.加人相应休积的TaqDVA聚合酶.混匀，按【个反应体系/支分装到0.2mLPCR管中。分别加人相应体积的各样品逆转录cDNA。8.2.4将上述加有逆转录cDVA的PCR管按以下程序行扩增：94℃预变性5min：94变性30s、60℃退火30s.72℃延仲30s.40个循环；72℃延仲5min4℃保温。8.2.5可使用同等效果的逆转录或步法RTPCR商品化试剂盒进行操作表1RT-PCR的PCR反应预混物所需试剂·组成试剂
10×PCR绥冲液（元Mg）
MgClz (25 mmol/L)
d>TPs各2.5mmal/L)
引物9992F(10mmol/1.)
引物9195R(10mol/L)
灭菌双蒸水
Ta4 DNA聚合酶（5U/pL)
注；25μ体系的模板为μ逆转录DNA，8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
25ml.体系
15,2 L
战剂终浓度
1×PCR缓冲液
2 mmal/l
200 mmol/l.
0.4pμmal/1.
0.4 pμnal/L
0.06 U/μL
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶.加人10mg/mLEB室终浓度0.5g/mL，摔勾，制备琼脂糖凝胶。8.3.2将5μLPCR反应物与1uL6×载样缓冲液混勾后加人到加样孔中，同时设立DNA分子量标准对照：
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向止极移动。当载样缓冲液中的溴盼蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。
8.3.4如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序，9结果判定
检测结果成立条件
阳性对照在231bp处有特定条带、阴性对照在231bp处无条带H空白对照不出现任何条带，试验有效。
9.2检测结果判定
检测样品在231bp处有条带，HPCR产物测序结果同参考序列（参见附录（)进行比对，结果符合的可判为RT-PCR结果阳性检测样品在231bp处无条带可判为RT-PCR结果阴性，-rrKaeerkAca-
A.1无RNA酶的75%乙醇
无水乙醇(新元瓶）
加人DEPC处理水
附录A
（规范性）
试剂配方
GB/T 40257—2021
在无RVA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1mL/支~-1.2mL/支分装丁无RNA酶的1.5mL离心誉巾，保存于一20℃待用
A.250×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pII8.o)
加水定容至
室温贮存。
31×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容牟
室温贮存。
A.410mg/mLEB贮存液
1000ml
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶中。5
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附录B
（资料性）
桃拉综合征简介
桃拉综合征（infectionwithtaura syndromevirus）是由桃拉综合征病毒（TSV)孔起的对虾严重流行病，TSV的形态为止二「而体结构，直径32nm.无囊膜.氯化铠浮力密度1.338g/ml，在细胞质内复制，核酸为正链单股线性RNA，长度约10205个核苷酸，其衣壳1要由三种多肽（VP1、VP2和VP3）组成。TSV至少包括四个基因群，分别是美洲群、东南亚群、伯利兹群和委内瑞拉群、自前，TSV广泛分布丁美洲、东南亚和中东等对虾养殖地区。1992年，瓜多尔养殖的凡纳滨对虾巾次发牛TSV感染疫情：随着受感染仔虾和亲虾运输，TSV快速传播到关洲，1999年，传人巾国台北，继而影响中国大陆、泰国、马来西业和印度尼西业，并成为各地区对虾高死广率的主要流行病原。
TSV易感品种包括细角滨对虾、凡纳滨对虾、刀额新刘虾（Metupenueusensis）、褐对虾（Penaeusaztecus）斑节对虾（P.monodton）白对虾（P，setiferus），主要感染l4日4o日龄仔虾，稚虾或成虾初次过到病毒时也易被感染。
感染分三个不同阶段，即：急性期、过渡期和慢性期，1各阶段痛状明显不同急性期：TSV急性感染期的濑死凡纳滨对虾全身呈浅红色，尾扇和泳足呈鲜红色，亦曾被俗称为“红尾病”，对虾常在蜕皮时死广，且在蜕皮阶段晚期出现壳变软、空肠等典型症状。因濒死虾多漂浮丁池边或水面，疫病暴发高峰期问可见数以「计的游鸟（海、熊鸥、岱鹭、等)聚集在池边或水面捕食病虾。经显微镜观察病虾附肢（如木端尾肢或腹肢)，可见病灶处表皮上皮坏死：过渡（恢复)期：该吋期的种群中可能仍有尚多急性感染期对虾，死亡率仍很高，虾池中可见对虾表皮随机出现多处不规则的由血细胞积累而成的黑色病灶，表皮变软及红色素扩散，行为和摄食保持正常。
慢性期：过渡期的病虾在蜕皮后转人慢性期·病声感染持续，但无明显症状此感染期的细角滨对虾对止常境刺激（如盐度突然降低等）的抵抗力低于无感染对虾。该期唯典型病变为淋巴组织扩人，并出现多个淋巴器官小球（I.（S）。当怀疑TSV慢性感染时.可结合分了生物学方法进行确诊-riKacerKAca-
附录C
(资料性）
桃拉综合征病毒RT-PCR产物序列GB/T40257—2021
CTTTGGGCAAAGTAGACAGC CGCGCTTGCG TGGTGGGACT TAATTAATGCCTGCTAACCC99921
AGTTGAAATT GATAATTTTG ATACAACAAC CAGTGGAGGA CTAATTCCAG GAGGTAGTGT121
TACAAACAGT GAAGGTTCTA CAATCTTGAT GAATGATATC CCAATCACTA ATCAGAATGTAGTGCTGTCT AAGAAIGTAA CAGATAAT GTTTGAAGTC CAGGACCAAG CTCTCATTGA181
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中华人民共和
国家标准
桃拉综合征诊断规程RT-PCR检测法GB/T 4G2572021
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2021年5月第一版
书号：155066·168308
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侵权必究
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桃拉综合征诊断规程
RT-PCR检测法
Code of diagnosis for infection with taura Syndrome virus-RT-PCR method2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T 40257—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出，本文件由全国水产标准化技术委员会（SA/T156）归口本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：万晓媛、杨冰、黄健、李清、史成银、张锋、宋晓冷、余卫忠、张庆利、李晨、许华、刘莉。
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1范围
桃拉综合征诊断规程RT-PCR检测法GB/T40257—2021
本文件规定了桃拉综合征诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对桃拉综合征病毒（taurasyndromevirus，TSV），给出了RT-PcR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定：
本文件适用于对虾各生活期样品中TSV带毒情况的定性检测.以进行桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本支件。
GB/T28630.4—2012白斑综合征（WSD)诊断规程：第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩咯语适用于本文件，
bp：碱基对(basepair）
cDNA：互补脱氧核核酸（complementaryDNA）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyPyrocarbonate）DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleicacid)dNTPs：脱氙核糖核苷三磷酸（dcoxy-rihonucleosidetriphosphatc）EB：浪化乙锭（eihidiunbromide）EDTA:乙胺四乙酸(ethylenediamineletraacetic acid)MMLV：莫洛尼鼠血病病毒（moloneymurineleukeminvirus）PCR：聚合酶链式反成（polymerascchainrcaction）RNA·核糖核酸(ribonuclcic acid)RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polytnerasechain reaction）Tuq：水生栖热菌（thermus aquaticus)Tris:三羟甲基氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane)TsV：桃拉综合征病毒（taurasyndromevirus）1
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GB/T40257—2021
5试剂或材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.2DEPC 处理水:生化试剂
TRIzolTV总R.VA提取试剂：生化试剂.或其他等效产品。氯伤。
兄丙醇。
无水乙醇
无RNA酶的75%乙醇:按附录A巾A,1配制，5.8
RNA酶抑制剂(RNasin或 RNase Inhibitor,40 L/uL).牛化试剂，一20 C保存。5.9
M-MI.V逆转录酶（200U/rl.）：生化试剂，一20℃保存，5.105X.M-MLV逆转录酶缓冲液：生化试剂，一20℃保存。5.11VTPs（各1ommol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物20℃保存.用于逆转录。
5.12dVTPs(各 2.5 mmol/L)：生化试剂，含 dATP、dTTPdGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物20℃保存.用于PCR，
5.1310×PCR缓冲液：生化试剂，无Mg-离了，-20℃保存：5.14MgCl(25 mmol/L):生化试剂.—20℃保存5.15TaqDNA聚合酶（5L/μL)：生化试剂，—20℃保存5.16I物9992F(10μmol/L)+5AAGTAGACAGCCGCGCTT35.17引物 9195R(10 mol/L):5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-35.18RT-PCR检测阳性对照：已知受TSV感染HRT-PCR结果显示阳性的对虾组织样品：一80℃保存。
5.19RTPCR检测阴性对照：已知未受TSV感染ⅡRTPCR结果显示阴性的对虾组织样品，一80℃保存，
RT-PCR检测空白对照:DEPC处理水，5.20
5.2150×电泳缓冲液：按A.2配制。5.221X电泳缓冲液：按A.3配制。5.23琼脂糖：生化试剂
5.24DVA分子量标准：生化试剂，5.25
6×载截样缓冲液：生化战剂：
10mg/mLEB贮存液：按A.4配制，或其他等效产品。6仪器设备
6.1 PCR仪
6.2电泳仪。
6.3水平电泳槽。
紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速冷冻离心机
水浴锅或金属浴。
普通冰箱。
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6.8-80℃超低温冰箱、
6.9电炉或微波炉等其他加热设备。GB/T40257—2021
6.10微量移液器：量程0.510、2~2020μ200100~10007样品
7.1采样对象
凡纳滨刘虾（Litopenaeusuanmamei）和细角滨对虾（L，stylirostris）等易感刘虾。参见附录B.7.2
采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合（13/128630,42012中附录[3的要求7.3样品的采集
7.3.1对虾仔虾取完整个体：幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸甲（淋巴器官、鳃丝、触角腺等）和附肢，
7.3.2分子生物学检测时，存虾或未达到0.5样品川以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测：所取样品分别置于1.5mI.无RVA酶离心管中，立.即进行RNA提取操作或加入相应体积TRIzolTM总RNA提取试剂,暂时保存于一20℃8试验步骤
8.1RNA的提取
8.1.1取30mg~-50mg样品.加l人0.5mL1mLTRIzolm总RNA提取试剂.研磨，室温放置5min4，【2000r/min离心5min，取「清至新的无RVA酶离心管中。提取过程同时设置即性对照和阴性对照。
8.1.2川入1/5体积的氯仿，混合至溶液乳化呈乳色，室温放置5min8.1.34℃.12000r/min离心15min。仔细吸取1层水相.移至新的无RVA酶离心管中。8.1.4加入等体积的异内醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。8.1.54 ,12 000 r/min离心10 min,弃1清。8.1.6加人1mL无RNA酶的75%乙醇（4℃预冷），上下颠倒洗涤沉淀，再丁4℃,7000r/min离心5min.小心弃上清：空温晾十沉淀8.1.7加人20μL～100μL.DEPC处理水溶解沉淀.立即用于RT-PCR或保存于一80备用。8.2RT-PCR操作
8.2.1配制逆转录引物预混液休系，分装为5l/管.使每反应管含4l.IDEPC处理水、1l10μmol/L可引物9195R.保存于—20℃，临用前，川人1μL（质量浓度：1ng/μL~1000ng/μL）待测RNA样品。70C顶变性10min后，即刻放人冰浴中冷却2min，同时设置以DEPC处理水为模板的空白对照
8.2.2配制逆转录酶预混物，配制方法为：2L.5×M-VIV逆转录酶缓冲液、0.5I.dNTPs（各10 mmol/L),0.25 μL RNase Inhibitor(40 U/μL),0.5 L M-MLV逆转录酶(200 U/μL),加 0.75 μLDEPC处埋水补足至4μL，混勺后，川至8.2.1中的样品管.稍离心，置于42℃水浴锅或金属浴巾反成1h，70℃15min后.可获得cDNA模板3
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GB/T 40257—2021
8.2.3PCR反应体系：按照表1的要求，配制成除TagDVA聚合酶以外的大体积预混物，分装保存于20℃，临用前.加人相应休积的TaqDVA聚合酶.混匀，按【个反应体系/支分装到0.2mLPCR管中。分别加人相应体积的各样品逆转录cDNA。8.2.4将上述加有逆转录cDVA的PCR管按以下程序行扩增：94℃预变性5min：94变性30s、60℃退火30s.72℃延仲30s.40个循环；72℃延仲5min4℃保温。8.2.5可使用同等效果的逆转录或步法RTPCR商品化试剂盒进行操作表1RT-PCR的PCR反应预混物所需试剂·组成试剂
10×PCR绥冲液（元Mg）
MgClz (25 mmol/L)
d>TPs各2.5mmal/L)
引物9992F(10mmol/1.)
引物9195R(10mol/L)
灭菌双蒸水
Ta4 DNA聚合酶（5U/pL)
注；25μ体系的模板为μ逆转录DNA，8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
25ml.体系
15,2 L
战剂终浓度
1×PCR缓冲液
2 mmal/l
200 mmol/l.
0.4pμmal/1.
0.4 pμnal/L
0.06 U/μL
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶.加人10mg/mLEB室终浓度0.5g/mL，摔勾，制备琼脂糖凝胶。8.3.2将5μLPCR反应物与1uL6×载样缓冲液混勾后加人到加样孔中，同时设立DNA分子量标准对照：
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向止极移动。当载样缓冲液中的溴盼蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。
8.3.4如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序，9结果判定
检测结果成立条件
阳性对照在231bp处有特定条带、阴性对照在231bp处无条带H空白对照不出现任何条带，试验有效。
9.2检测结果判定
检测样品在231bp处有条带，HPCR产物测序结果同参考序列（参见附录（)进行比对，结果符合的可判为RT-PCR结果阳性检测样品在231bp处无条带可判为RT-PCR结果阴性，-rrKaeerkAca-
A.1无RNA酶的75%乙醇
无水乙醇(新元瓶）
加人DEPC处理水
附录A
（规范性）
试剂配方
GB/T 40257—2021
在无RVA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1mL/支~-1.2mL/支分装丁无RNA酶的1.5mL离心誉巾，保存于一20℃待用
A.250×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pII8.o)
加水定容至
室温贮存。
31×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容牟
室温贮存。
A.410mg/mLEB贮存液
1000ml
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶中。5
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GB/T40257—2021
附录B
（资料性）
桃拉综合征简介
桃拉综合征（infectionwithtaura syndromevirus）是由桃拉综合征病毒（TSV)孔起的对虾严重流行病，TSV的形态为止二「而体结构，直径32nm.无囊膜.氯化铠浮力密度1.338g/ml，在细胞质内复制，核酸为正链单股线性RNA，长度约10205个核苷酸，其衣壳1要由三种多肽（VP1、VP2和VP3）组成。TSV至少包括四个基因群，分别是美洲群、东南亚群、伯利兹群和委内瑞拉群、自前，TSV广泛分布丁美洲、东南亚和中东等对虾养殖地区。1992年，瓜多尔养殖的凡纳滨对虾巾次发牛TSV感染疫情：随着受感染仔虾和亲虾运输，TSV快速传播到关洲，1999年，传人巾国台北，继而影响中国大陆、泰国、马来西业和印度尼西业，并成为各地区对虾高死广率的主要流行病原。
TSV易感品种包括细角滨对虾、凡纳滨对虾、刀额新刘虾（Metupenueusensis）、褐对虾（Penaeusaztecus）斑节对虾（P.monodton）白对虾（P，setiferus），主要感染l4日4o日龄仔虾，稚虾或成虾初次过到病毒时也易被感染。
感染分三个不同阶段，即：急性期、过渡期和慢性期，1各阶段痛状明显不同急性期：TSV急性感染期的濑死凡纳滨对虾全身呈浅红色，尾扇和泳足呈鲜红色，亦曾被俗称为“红尾病”，对虾常在蜕皮时死广，且在蜕皮阶段晚期出现壳变软、空肠等典型症状。因濒死虾多漂浮丁池边或水面，疫病暴发高峰期问可见数以「计的游鸟（海、熊鸥、岱鹭、等)聚集在池边或水面捕食病虾。经显微镜观察病虾附肢（如木端尾肢或腹肢)，可见病灶处表皮上皮坏死：过渡（恢复)期：该吋期的种群中可能仍有尚多急性感染期对虾，死亡率仍很高，虾池中可见对虾表皮随机出现多处不规则的由血细胞积累而成的黑色病灶，表皮变软及红色素扩散，行为和摄食保持正常。
慢性期：过渡期的病虾在蜕皮后转人慢性期·病声感染持续，但无明显症状此感染期的细角滨对虾对止常境刺激（如盐度突然降低等）的抵抗力低于无感染对虾。该期唯典型病变为淋巴组织扩人，并出现多个淋巴器官小球（I.（S）。当怀疑TSV慢性感染时.可结合分了生物学方法进行确诊-riKacerKAca-
附录C
(资料性）
桃拉综合征病毒RT-PCR产物序列GB/T40257—2021
CTTTGGGCAAAGTAGACAGC CGCGCTTGCG TGGTGGGACT TAATTAATGCCTGCTAACCC99921
AGTTGAAATT GATAATTTTG ATACAACAAC CAGTGGAGGA CTAATTCCAG GAGGTAGTGT121
TACAAACAGT GAAGGTTCTA CAATCTTGAT GAATGATATC CCAATCACTA ATCAGAATGTAGTGCTGTCT AAGAAIGTAA CAGATAAT GTTTGAAGTC CAGGACCAAG CTCTCATTGA181
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桃拉综合征诊断规程RT-PCR检测法GB/T 4G2572021
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2021年5月第一版
书号：155066·168308
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