SN/T 3306.12-2017
基本信息
标准号： SN/T 3306.12-2017
中文名称：国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第12部分:空肠弯曲菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 介导 恒温 扩增 检测 方法 空肠 弯曲
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3306.12-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 12 :Campylobacter jejuni.
1范围
SN/T 3306.12规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增(LAMP)法检测空肠弯曲菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3306.12适用于国境口岸空肠弯曲菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.9食品安全国家标准 食 品微生物学检验空肠弯 曲菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录(卫科教发(2006)15号)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP :脱氧核苷三磷酸( deoxyriborucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid)
LAMP :环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification)
Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
4生物安全及防污染措施
实验操作及处理按照GB 19489及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
1范围
SN/T 3306.12规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增(LAMP)法检测空肠弯曲菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3306.12适用于国境口岸空肠弯曲菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.9食品安全国家标准 食 品微生物学检验空肠弯 曲菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录(卫科教发(2006)15号)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP :脱氧核苷三磷酸( deoxyriborucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid)
LAMP :环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification)
Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
4生物安全及防污染措施
实验操作及处理按照GB 19489及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.12—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第12部分：空肠弯典菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part12:Campylobacterjejuni
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；bzxz.net
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌：
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：症原虫；
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第12部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3306.12—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：詹曦菁、李君萍、柴宏森、祁军。1
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第12部分：空肠弯曲菌
SN/T3306.122017
SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP）法检测空肠弯曲菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告南的筛选检测
本部分适用于国境口岸空肠弯曲菌2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.9食品安全国家标准
食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格
各和试验方法
GB19489实验室生物安全通用要求临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用WS/T230
感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫科教发2006715号）
3缩略语
下列缩略语适用于本文件
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行.由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据空肠弯曲O基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的hipO基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链1
SN/T3306.12—2017
上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求6.1
引物。
根据空肠弯曲菌特有的hipO靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1(F3，5*-3）：GAAGAAGCCATCATCGCA外引物2（B35-3）：AATAGGACTTCGTGCAGATATG内引物1(FIR，5\-3\）：TGCTGAAGAGGGTTTGGGTGCATATTGTGCCATCCA内引物2(BIP,5-3\）：GCTAAATACTTTGCAGCAAGCAGCTTTGCCTTTACAAGAATGC环状引物1(LF，5-3）：GGTGCTAAGGCAATGATAGAAG环状引物2(LB.5-3）：CATCATGACCGCAAGCATG2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl（pH8.0）.2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.2
6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。6.4BstDNA聚合酶：8U/μL
10XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH,）,SO、6.5
100mmol/LKCl.20mmol/LMgSO4.1%TritonX-100。6.6MgSO4溶液：25mmol/L。
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。6.9
阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。Bolton肉汤。
0.2mL和1.5mL、10mL塑料离心管。6.11
吸头，配套移液器使用。
无菌匀质袋（带滤网）。
仪器设备
移液器：量程0.1μL~2μ.量程0.5μ~10μL，量程10μ~100μL，量程100μL~1000μL7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃土1℃。7.4恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。7.5微需氧培养装置：提供微需氧培养条件（5%O2、10%CO2、85%N2）。7.6
计时器。
8检测程序
空肠弯曲菌检测程序见图1。
9操作步骤
样本采集
样本的增菌及分离培养
样本前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经分离培养鉴定确认
图1空肠弯曲菌LAMP检测程序
9.1样本采集、细菌增菌及分离培养按照GB4789.9、WS271执行。
9.2样本前处理
9.2.1粪便样本的前处理
SN/T3306.12—2017
选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份粪便标本放置于装有6mLPBS(0.05mol/L，pH7.4）的离心管中，振荡混匀5min10min后，500g离心5min，收集上清液，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL双蒸水（ddHzO)中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL（-20℃）预冷的无水乙醇中，振荡混勾后，7000g离心2min，弃上清液，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可直接用于后续DNA提取。
9.2.2食物标本的前处理
取可疑食物约25g放人盛有225mLBolton肉汤的有滤网的无菌勾质袋中，用拍击式匀质器匀质约1min～2min，将滤液在微需氧条件下，36℃土1℃培养4h，之后42℃±1℃培养48h增菌。取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。3
SN/T3306.12—2017
3可疑菌落的前处理
分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。9.3模板DNA的提取
加热煮沸法
向前处理后得到的沉淀中加入100μLDNA提取液；水样便直接取100μL加入100μLDNA提取液；直接挑取1个～2个可疑菌落加入100μLDNA提取液。之后将上述提取混合液其置于沸水浴10min，7000g离心2min，收集上清液作为扩增模板，于一20℃保存备用。9.3.2试剂盒提取
按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作9.4环介导恒温核酸扩增
反应体系
空肠弯曲菌的hipO基因环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可使用市售商品化检测试剂盒。表1空肠弯曲菌环介导引物恒温扩增反应体系试剂名称
10XThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIP引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BstDNA聚合酶
反应过程
储备液浓度
pumol/L
40μmo
100μnol/L
100pmol/L
10mmol/L
150mmol/L
8U/μl
体系加样量
按照表1所述配制反应体系，上述组分加入后，轻柔混勾并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封液），最后将1uL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。9.4.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置空白对照，阴性对照和阳性对照4
空白对照则采用无菌水作为扩增模板阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板9.5
结果观察
SN/T3306.12—2017
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
9.6结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：
阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阳性。如需对a）
上述结果进行确认，则需进行分离培养鉴定，可按GB4789.9、WS271执行。b)
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阴性。S
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第12部分：空肠弯典菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part12:Campylobacterjejuni
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；bzxz.net
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌：
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：症原虫；
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第12部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3306.12—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：詹曦菁、李君萍、柴宏森、祁军。1
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第12部分：空肠弯曲菌
SN/T3306.122017
SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP）法检测空肠弯曲菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告南的筛选检测
本部分适用于国境口岸空肠弯曲菌2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.9食品安全国家标准
食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格
各和试验方法
GB19489实验室生物安全通用要求临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用WS/T230
感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫科教发2006715号）
3缩略语
下列缩略语适用于本文件
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行.由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据空肠弯曲O基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的hipO基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链1
SN/T3306.12—2017
上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求6.1
引物。
根据空肠弯曲菌特有的hipO靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1(F3，5*-3）：GAAGAAGCCATCATCGCA外引物2（B35-3）：AATAGGACTTCGTGCAGATATG内引物1(FIR，5\-3\）：TGCTGAAGAGGGTTTGGGTGCATATTGTGCCATCCA内引物2(BIP,5-3\）：GCTAAATACTTTGCAGCAAGCAGCTTTGCCTTTACAAGAATGC环状引物1(LF，5-3）：GGTGCTAAGGCAATGATAGAAG环状引物2(LB.5-3）：CATCATGACCGCAAGCATG2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl（pH8.0）.2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.2
6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。6.4BstDNA聚合酶：8U/μL
10XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH,）,SO、6.5
100mmol/LKCl.20mmol/LMgSO4.1%TritonX-100。6.6MgSO4溶液：25mmol/L。
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。6.9
阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。Bolton肉汤。
0.2mL和1.5mL、10mL塑料离心管。6.11
吸头，配套移液器使用。
无菌匀质袋（带滤网）。
仪器设备
移液器：量程0.1μL~2μ.量程0.5μ~10μL，量程10μ~100μL，量程100μL~1000μL7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃土1℃。7.4恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。7.5微需氧培养装置：提供微需氧培养条件（5%O2、10%CO2、85%N2）。7.6
计时器。
8检测程序
空肠弯曲菌检测程序见图1。
9操作步骤
样本采集
样本的增菌及分离培养
样本前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经分离培养鉴定确认
图1空肠弯曲菌LAMP检测程序
9.1样本采集、细菌增菌及分离培养按照GB4789.9、WS271执行。
9.2样本前处理
9.2.1粪便样本的前处理
SN/T3306.12—2017
选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份粪便标本放置于装有6mLPBS(0.05mol/L，pH7.4）的离心管中，振荡混匀5min10min后，500g离心5min，收集上清液，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL双蒸水（ddHzO)中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL（-20℃）预冷的无水乙醇中，振荡混勾后，7000g离心2min，弃上清液，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可直接用于后续DNA提取。
9.2.2食物标本的前处理
取可疑食物约25g放人盛有225mLBolton肉汤的有滤网的无菌勾质袋中，用拍击式匀质器匀质约1min～2min，将滤液在微需氧条件下，36℃土1℃培养4h，之后42℃±1℃培养48h增菌。取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。3
SN/T3306.12—2017
3可疑菌落的前处理
分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。9.3模板DNA的提取
加热煮沸法
向前处理后得到的沉淀中加入100μLDNA提取液；水样便直接取100μL加入100μLDNA提取液；直接挑取1个～2个可疑菌落加入100μLDNA提取液。之后将上述提取混合液其置于沸水浴10min，7000g离心2min，收集上清液作为扩增模板，于一20℃保存备用。9.3.2试剂盒提取
按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作9.4环介导恒温核酸扩增
反应体系
空肠弯曲菌的hipO基因环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可使用市售商品化检测试剂盒。表1空肠弯曲菌环介导引物恒温扩增反应体系试剂名称
10XThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIP引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BstDNA聚合酶
反应过程
储备液浓度
pumol/L
40μmo
100μnol/L
100pmol/L
10mmol/L
150mmol/L
8U/μl
体系加样量
按照表1所述配制反应体系，上述组分加入后，轻柔混勾并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封液），最后将1uL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。9.4.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置空白对照，阴性对照和阳性对照4
空白对照则采用无菌水作为扩增模板阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板9.5
结果观察
SN/T3306.12—2017
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
9.6结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：
阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阳性。如需对a）
上述结果进行确认，则需进行分离培养鉴定，可按GB4789.9、WS271执行。b)
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阴性。S
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