SN/T 4865-2017.Detection and identification of Phomopsis longicolla Hobbs.
1范围
SN/T 4865规定了进出境大豆种子及其夹带的植物残体中大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsislongicolla Hobbs)的检疫鉴定方法。
SN/T 4865适用于大豆拟茎点种腐病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2122进出境 植物及植物产品检疫抽样方法
3基本信息
学名:Phomopsis longicolla Hobbs
分类地位:半知菌亚门Deuteromycotuna,腔孢纲Coelomycetes球壳孢目Sphaeropsidales,球壳孢科Sphaeropsidaceae,拟茎点霉属Phomopsis。其有性态为间座克属，自然界内未发现。
传播途径:随带菌种子、植株或残体的调运作远距离传播。
大豆拟茎点种腐病的地理分布、寄主为害状等信息参见附录A。
4原理
以大豆拟茎点种腐菌培养性状、形态特征及实时荧光PCR检测结果作为检疫鉴定的主要依据,寄主、地理分布及为害症状作为辅助鉴定依据。
5仪器和用具
5.1 仪器
生物显微镜(带显微照相装置)、体式显微镜、超净工作台、电子天平、光照培养箱.高压灭菌锅、实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机、金属浴、冰箱、移液器等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4865—2017
大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phomopsis longicolla Hobbs2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4865—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、姚剑、段维军、孙娟娟、郑海松I
1范围
大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法SN/T4865—2017
本标准规定了进出境大豆种子及其夹带的植物残体中大豆拟茎点种腐病菌（PhomopsislongicollaHobbs)的检疫鉴定方法。
本标准适用于大豆拟茎点种腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3基本信息
学名：PhomopsislongicollaHobb:分类地位：半知菌亚门Deuteromyqotuna，腔孢纲Coelomycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢科Sphaeropsidaceae，拟茎点霉属Phomopsis。其有性态为间座壳属，自然界内未发现。运作远距离传播
传播途径：随带菌种子、植株或残体的调大豆拟茎点种腐病的地理分布、寄主、为害状等信息参见附录A。4原理
正及实时荧光PCR检测结果作为检疫鉴定的主要依据，寄以大豆拟茎点种腐菌培养性状，形态特主、地理分布及为害症状作为辅助鉴定依据5仪器和用具
5.1仪器
生物显微镜（带显微照相装置）、体式显微镜、超净工作台、电子天平、光照培养箱、高压灭菌锅、实时荧光PCR仪，高速冷冻离心机金属浴，冰箱、移液器等。5.2用具
培养皿、烧杯、三角瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、挑针、滤纸、标签等6试剂和培养基
6.1试剂
75%酒精，85%乳酸、1%次氯酸钠、实时荧光PCR反应预混液、去离子水等。除另有规定外，所有1
SN/T4865—2017
试剂均为分析纯。
2培养基
马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：称取马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，加人1000mL蒸馏水后加热搅拌溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后倒平板。酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）：按照PDA配方配制，高压灭菌后冷却至5O℃，用过滤除菌的85%乳酸调节pH至4.5后倒平板。7抽样方法
按照SN/T2122中的规定进行抽样。8鉴定方法
8.1症状检查
搜集并检查样品中夹带的豆英或茎秆上是否有沿着茎秆成行排列的黑色斑点，观察种子是否存在皱缩、延长开裂，扁平状，是否覆盖有白色毒层8.2保湿培养
8.2.1种子保湿培养
选取疑似感病样品，用1%次氯酸钠处理60s进行表面灭菌，无菌水漂洗3次后，放在垫有三层灭菌湿滤纸的培养皿中，25℃～28℃12h光照12h黑暗交替条件下保湿培养7天以上，观察是否出现白色菌丝。
APDA培养
挑取少量白色菌丝转到APDA上，25℃~28℃12h光照12h黑暗交替条件下培养，长出典型菌落和产孢结构后，转接至PDA培养基上，待长出分生孢子后，观察分生孢子器、分生孢子梗、产孢结构及分生孢子的形状，并测量大小。8.3实时荧光PCR检测
采用特异性引物探针pltef-F/pltef-R/pltef-P对分离出的疑似菌株DNA进行实时荧光PCR检测，用大豆拟茎点种腐菌株作阳性对照，用非大豆拟茎点种腐菌的植物病原细菌DNA作阴性对照，用无菌水作空白对照，进行实时荧光PCR扩增（见附录B）。9病菌形态特征
大豆拟茎点种腐病菌的培养性状、形态特征及与近似种的区别见附录C。10结果判定
如分离菌的形态特征与附录C中描述的大豆拟茎点种腐病的特征相符，且实时荧光PCR检测结果为阳性，即可判定为大豆拟茎点种腐病菌PhomopsislongicallaHobbs。2
样品与菌种保存
SN/T4865—2017
分离得到的大豆拟茎点种腐菌转接在PDA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4℃保存定期转接。有条件可进行冷冻干燥保存。检出大豆拟茎点种腐菌的样品妥善保存6个月。保存期满灭活处理。
SN/T4865—2017
A.1分布
亚洲：韩国、中国。
美洲：美国、阿根廷
附录A
（资料性附录）
大豆拟茎点种腐病菌相关资料
欧洲：意大利、克罗地亚、希腊、前南斯拉大洋洲：澳大利亚。
A.2寄主
苟麻Abutilontheophrasti、元宝械Acertruncatum婴叶豚草Ambrosiatrifida，Astererilis、Caperonia palustrisDesmanthus illinoensis 斑地锦Euphorbia maculata，鳝肠 Eclipta prostrata大地锦Euphorbianutans、大豆GlycinemarIpomoea扁蓄萝Polygonumaviculare、皱叶酸模Solanum melongena、豇豆Vigna unguiculata、苍耳子XanthiumRumercrispus，Sida spinosa，茄子strumarium等。
A.3为害状
大豆拟茎点种腐病的主要症状表现为当框植株进入成熟期，豆英和茎杆明显枯萎，茎秆和豆荚上覆盖有黑色的小斑点，这些斑点就是病原真菌的发生在茎秆的部分区域，发病区域接近十
现无规则点状。受感染的种子显现见出从
带菌，受感染但不表现症状。严重感染的霉层。感病种子常不发芽或发芽缓实体·通常沿
茎秆上成行排列。气候不适宜时，病菌只美表面，
处在茎科
杆的结点
斑有时也可在干扁的豆荚上呈
到症状明显不同的
症状到
小观健康的种子也能在种皮上
等级外
开裂、扁平，并呈白垩状，部分或全部覆盖白色缩延长
B.1菌株DNA的制备
附录B
（规范性附录）
大豆拟茎点种腐病菌分子生物学检测SN/T4865—2017
挑取少量培养物置于1.5mL离心管中，加人300μL无菌去离子水，沸水浴20min。冷却后备用。B.2引物和探针
大豆拟茎点种腐病菌特异性引物及探针：pltef-F：5-AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3*;pltef-
R:5-GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT-3:pltef-P5-FAM-TCTGCTCCAGAGAGCTT-MGB
3'。引物和探针由提供商品化服务的公司合成B.3
反应体系
用pltef-F、pltef-R和pltef-P对模板DNA进行实时荧光PCR反应，反应体积20μL：2×PCR反应
预混液10μL10μM引物和探针各1L、模板2L.无菌去离子水补足
置于实时荧光PCR仪中进行反应。20μL。将反应体系混匀后
以无菌去离子水为空白对照，以大豆拟茎点种腐病菌DNA为阳性对照，以不含有大豆拟茎点种腐次。
病菌DNA的模板为阴性对照，每个样品重复2B.4扩增条件
94℃5min：94℃15s;60℃30s:40B.5结果判读
个循环
在阳性对照能够正常扩增的前提下，若待检样品扩增结果
小于35，则判定实时荧光PCR检
测结果为阳性；若待检样品扩增结果Ct值大于或等于35，则重新制备浓度较高的DNA模板，重新扩增。再次扩增后，若待检样品Ct值仍大于或等于35，则判定该样品实时荧光PCR检测为阴性：若待检样品Ct值小于35，则判定该样品实时荧光PCR检测为阳性。5
SN/T4865—2017
附录C
（规范性附录）
大豆拟茎点种腐病菌培养性状、形态特征及与近似种的区别C.1培养性状及形态特征
保湿培养后，受该病菌感染的植物材料表面长出白色、絮状、致密的菌丝，并常伴有小黑点（分生孢子器）。该病菌在PDA培养基上25℃12h光照12h黑暗培养1周左右能够长满培养皿，2周后开始长出子实体，培养基背面可见较大的黑色的子座。菌落白色，呈密集的丛卷毛状，有时部分区域显黄绿色（图C.1）。分生孢子器着生于黑色子座上，长度100μm250μm，黑色圆简状，单生或聚生，分生孢子器基部略膨大，顶部钝圆，颈部突出，腔室有单孔或多孔口，球形。有时可见其顶端有黄白色分生孢子液溢出（图C.1）。分生孢子梗无色，单生或者有分枝，具分隔，大小（3.9um～23.8μm）×（1.5μm~3.9μm）。α型分生孢子纺锤形，两端稍钝，透明，单胞，通常含2个油球，大小（4.87μm～8.21μm）×（1.69um~3.02μm），平均6.43μm×2.31μm，长宽比2.81左右（图C.2）。β型分生孢子为长针状，较为罕见。未发现有性世代
说明：
感染大豆拟茎点种腐病菌的大豆种子在PDA培养基上培养20天（来源https：//commons.wikimedia.org/A
wiki/File：Phomopsis_longicollal.tif#/media/File：Phomopsis_longicollal.tif);B—大豆拟茎点种腐病菌在酸性PDA上培养14天（25℃，12h光照12h黑暗）。图C.1大豆拟茎点种腐病菌培养特征6
说明：
PL为害大豆茎秆状；
PL在PDA培养基上形成的子座：
分生孢子梗：
a型分生孢子。
比例尺：A=900μmB=800μm;C，D=12μm；E=20μm。（来源：Udayangaetal.2015）图C.2大豆拟茎点种腐病菌（PL）为害状、培养性状及孢子形态C.2与近似种的区别
大豆拟茎点种腐病菌与近似种的区别见表C.1。表C.1大豆拟茎点种腐病菌与近似种的区别病菌名称
无性型
有性型
PDA上菌
落形态
无性型形态
大豆拟茎点种腐病
Phomopsis longicalla
未发现
菌落白色，呈密集的丛卷毛状，有时部分区域显黄绿色
分生孢子器长度100μm~
250μm，a型分生孢子透明，单
胞，梭形，含2个油球，大小
(4.87μm~8.21μm）×(1.69μm~3.02rm）.β型分生孢子极少见
大豆北方茎溃疡病菌
Phomopsis phaseolif.sp.
Caulivora Kulik
Diaporthe phasolorum
var.caulivora
丛毛状的白色菌落，后期变为黄色至茶色
未发现分生孢子和分生孢子器
SN/T4865-2017
大豆南方茎溃疡病菌
Phomopsis sp.
Diaporthe phasolorum var.免费标准下载网bzxz
meridionalis
白色·丛生长毛，老熟后变成
深褐色
在PDA培养基上生长4周后
形成钝圆的分生孢子器，内生
大量α型分生孢子。分生孢子
无色单胞，常含2个油球，孢子
大小（5.9μm8.0μm）×
(2.0μm~2.7μm）
SN/T4865—2017
病菌名称
有性型形态
未发现
大豆拟茎点种腐病
表C.1（续）
大豆北方茎溃疡病菌
子囊壳在不发达的小子座上形
成。子囊（5.0mm~6.5μm）×
（29.8μm~31.0μm），长棍棒状，壁薄，易消解，顶部有清晰的折光环。子囊孢子（2.43μm~3.24μm）X（10.1um~113um）.透明.纺锤
形，双胞，分隔处略缝缩，两室油球
大豆南方茎溃疡病菌
子囊、子囊孢子与北方茎溃疡
病菌类似，但更大。子囊壳扁
球形，着生于小而不发达的子
座：子囊（4.8μm~8.7μm）×
（34.8μm~41.1μm）.长棍棒
状，壁薄，易消解，顶部有清晰的折光环：子囊孢子（2.3μm~
4.2μm）×（7.4μm~13.2μm），无色，双胞，纺锤形，含4个油球
参考文献
［1]SN/T1189—2007大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法SN/T4865—2017
[2]］张建成，顾建锋，徐瑛，等.大豆拟茎点种腐病的研究进展及其检疫意义[J].植物检疫，2005，19(3):163-167.
［3］顾建锋，杨额，张建成，等.大豆拟茎点种腐病菌的分离与鉴定[J].植物检疫，2006，20（3）：133-136.
崔友林，段灿星，丁俊木，等
2010.32(1).99-103.
一种新发生的大豆艺枯病病原菌鉴定[门.中国油料作物学报［5］王颖，陈枝楠，程颖慧
，等用形态学方法检测大豆拟茎点种腐病菌Phomopsislongicolla.中国植物病理学会学术年会，2008[6]UdayangaD,CastleburyLA,ChukepatiroteE,etal.TheDiaporthesojaespeciescomplex:Phylogenetic re-assessment of pathogensFungalBiology.2015,119:383-407.ssociatedwithsoybean,cucurbitsand otherfield cropsLJ].[7]］严进，吴品珊.中国进境检疫性有害生物菌物卷［M.北京：中国农业出版社，2013.［8］陆家云.植物病原真菌学【M].北京：中国农业出版社，200】S
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