SN/T 3567.9-2017.Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 9 :Yersinia pestis.
1范围
SN/T 3567.9规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3567.9适用于鼠疫耶尔森菌筛查检测，以及对国境口岸出人境人员感染鼠疫耶尔森菌的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1280- 2014国境口岸鼠疫检验规程
WS 279- 2008鼠疫诊断标准
人间传染的病原微生物名录(卫生部2006)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1交叉引物恒温扩增技术crossing priming isothe mal amplification;CPA
一种核酸恒温扩增技术,CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶(DNA Poly-merase)外,还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Aeid,DNA)的循环扩增能不断的实现。
3.2交叉引物crossing primer
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5'末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点,促进扩增反应。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3567.9—2017
交叉引物恒温扩增检测方法
第9部分：鼠疫耶尔森菌
Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 9.Yersinia pestis
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：霍乱弧菌：
第3部分：大肠杆菌0157：H7：
第4部分：黄热病毒；
第5部分：沙门菌属：
第6部分：结核分枝杆菌：
第7部分：肠道病毒71型；
第8部分：症原虫：
第9部分：鼠疫耶尔森菌：
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：志贺菌。
本部分为SN/T3567的第9部分、
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3567.9—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：王馨、关淳、兰景、李浩辰、祁军、胡林、尤其敏。1范围
交叉引物恒温扩增检测方法
第9部分：鼠疫耶尔森菌
SN/T3567.9—2017
SN/T3567的本部分规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果的报告。
本部分适用于鼠疫耶尔森菌筛查检测，以及对国境口岸出人境人员感染鼠疫耶尔森菌的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1280—2014国境口岸鼠疫检验规程WS279—2008鼠疫诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫生部2006）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
crossing priming isothermal amplification,CPA交叉引物恒温扩增技术
一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶CDNAPoly-merase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)的循环扩增能不断的实现。3.2
交叉引物crossingprimer
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.3
剥离引物bumperprimer
位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。
SN/T3567.9—2017
检测引物detectionprimer
一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。
BstDNA聚合酶BstDNApolymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5-3'DNA聚合酶活性，但是去除了53核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（StrandDisplacement)。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）5生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）中的有关规定，应由具备相关资格的工作人员进行实验操作。所有废弃物也应按照GB19489中的有关规定执行。
6检测对象
鼠疫耶尔森菌菌株。
急热待查疑似感染鼠疫病人的淋巴结穿刺液、痰液、组织液等。7试剂和材料
7.1除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。7.2DNA提取试剂：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。7.310×ThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8)100mmol/L(NH4),SO、100mmol/LKCl.20mmol/LMgSO.、1%TritonX-100。7.4
10mmol/LdNTPs溶液：dATP.dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。7.5
BstDNA聚合酶：8U/μL。
甜菜碱溶液：5mol/L。
MgSO4溶液：100mmol/L
阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。7.9
阴性对照：DNA提取试剂。
TE缓冲液（pH7.4)：0.1mol/LTris-HCI(pH7.2)20mL加人0.5mol/LEDTA（pH8.0)4.0mL，用超纯水定容至200mL。高压灭菌后4℃保存。7.112%琼脂糖凝胶。
7.12Goldview:0.5μg/μL
7.13DNA分子标记物。
引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。参见附录A。7.15
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）：使用方法参见附录B。8仪器设备
任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。SN/T3567.9—2017
微量移液器：量程范围为0.1μL~2μL：0.5μL~10μL：10μL~100μL；100μL～1000μL。计时器。
超净工作台。
生物安全柜。
消毒灭菌锅。
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。
低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。
紫外凝胶电泳图像分析系统。
鼠疫耶尔森菌交叉引物恒温扩增法检测程序9
样品采集
按照SN/T1280—2014附录D中要求执行。细菌DNA提取的样本前处理
将待测样品按WS279—2008中附录C聚合酶链式反应（PCR)检测鼠疫耶尔森菌特异性基因所述标本处理方法进行样品处理。
9.3模板DNA提取
9.3.1沸水浴法
在处理后样本标本沉淀采用如下方法制备模板DNA：沉淀中加人8OμLDNA提取液，混勾后沸水浴10min；于7000g离心2min，上清液即为模板DNA；取上清液置一20℃保存备用，可存6个月。9.3.2试剂盒提取
按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。9.4交叉引物恒温扩增
9.4.1交叉引物恒温扩增引物
用于检测鼠疫耶尔森菌的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。3
SN/T3567.9—2017
9.4.2阳性对照、阴性对照和空白对照设置实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引物恒温扩增模板：阴性对照采用DNA提取液作为交叉引物恒温扩增模板：空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板。9.4.3交叉引物恒温扩增反应体系交叉引物恒温扩增反应检测鼠疫耶尔森菌的参考反应体系见表1。表1鼠疫耶尔森菌交叉引物恒温扩增反应体系试剂名称
10xThermoPol缓冲液
10mmol/LdNTPs
剥离引物F和R
交叉扩增引物F和R
检测引物F和R
甜菜碱
BstDNA聚合酶
9.4.4交叉引物恒温扩增反应程序将配制好的扩增反应液P
PCR管
交叉引物恒温扩增产物检测
储备液浓度
10mmol/L
20μnol/1
20μmol/L
20pmol/l
100.mmol/L
5mol/L
50ng/μLWww.bzxZ.net
20μL体系加样量
各0.1μL
补足反应体系至20mL
量于恒温仪器上63℃温浴60min。9.4.5.1扩增产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶电泳图像分析系统下观察分析扩增产物。可使用但不限于通过封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测交叉引物恒温扩增9.4.5.2
产物，该方法灵敏度较高，且可降低交叉污染的风险。具体操作步骤参见B.1。9.4.6检测结果判定
1电泳产生梯形条带判定为交叉引物恒温扩增检测阳性。9.4.6.2
可使用封闭式一次性核酸检测装置方法的结果描述及判定参见B.3。A1
剥离引物
交叉引物
检测引物
YPFITC
YPBIOTIN
附录A
（资料性附录）
鼠疫耶尔森菌CPA检测的引物序列5-GTTAGGAATTATTACTTTCGGC
5-TCCTAGACTGAATGAGAACC
SN/T3567.9—2017
5-AAGAGTATGGCGTGACTATCACCGAGACCATAACGCCA5-CACCGAGACCATAACGCCAAAGAGTATGGCGTGACTAT5-FITC-AAGAGTATGGCGTGACTAT
5-BIOTIN-TACCCGTTAGATGCTGC
SN/T3567.9—2017
附录B
（资料性附录）
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）B.1操作步骤及操作示意图
B.1.1将扩增后的反应管（不可开盖，以避免污染）放人封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的固定盒（内芯）中，合上固定盒后将其装人装置外盒B,1.2按手柄至检测装置于关闭状态（听见清脆的“咔味嗪”声）。B.1.3将检测装置放置在操作台上，请通过阅读窗判读结果。15min～30min为最佳判读时间，但不应超过2h。
B.1.4记录检测结果，丢弃检测装置在安全处。B.1.5
操作示意图见图B.1。
将扩增后未打开的PCR管
放入固定盒
合上手柄盖
B.2质控方法
阴性对照仅出现一条红线（在质控区C)。图B.1
合上固定盒
将固定盒插入外盒
压紧手柄盖并扣死
阳性对照出现两条红线：一条位于检测区（T)，另一条位于质控区（C）。B.2.3每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线，6
判读结果
结果描述及判定
SN/T3567.9—2017
仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无待测病原体：或其拷贝数低于该检测试剂的最低检测限。
B.3.2出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在待测病原体或基因。将检测线强度与色卡进行对照：>L4，为阳性：检测结果判读示意图
检测结果判读示意图见图B.2
质控线(C)
检测线(T)
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