GB/T 18647-2020.Diagnostic techniques for animal coccidiosis.
1范围
GB/T 18647规定了动物球虫病的临床诊断.病原检查.病理检查、综合判定的技术要求。
GB/T 18647适用于家禽(鸡、鸭、鹅等)、家畜(猪、牛、羊、马、兔等)、宠物(犬、猫等)球虫病(感染)的诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3临床诊断
根据发病临床特征,球虫病可分为急性型和慢性型。
急性型多发生于幼龄动物,病程初期表现为精神沉郁,嗜睡,被毛粗乱,食欲下降,腹泻。病程后期出现运动失调,食欲废绝,排出带血水样稀便,甚至是血便.具恶臭味,可视黏膜贫血、苍白，身体消瘦,甚至失重,最后因脱水、衰竭而死。
慢性型多见于大齡动物,无明显症状,主要表现为厌食,间歇性下痢.逐渐消瘦.生产性能下降等。
有以上临床症状者,可以怀疑为球虫病,确诊需进一步进行病原或病理检查。
4病原检查
4.1材料与试剂
4.1.1试剂: 饱和盐水，2.5%重铬酸钾溶液，配制方法分别见附录A中A.1和A.2,配制用水符合GB/T 6682-2008 三级水要求。
4.1.2 器材:样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60目和100目铜丝网或尼龙网、100 mL量筒、50 mL烧杯、50 mL离心管、10 mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18647—2020
代替GB/T18647—2002
动物球虫病诊断技术
Diagnostic techniques for animal coccidiosis2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T18647—2020
本标准代替GB/T18647—2002《动物球虫病诊断技术》。本标准与GB/T18647—2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：一“范围”部分增加了家畜（猪、牛、羊、马等）和宠物（犬、猫等）（见第1章）：增加了“临床诊断”部分（见第3章）；—“病原检查”部分增加了“样品采集、保存和运输”（见4.2）；“定性检查”和“定量检查”部分增加了不同动物粪便处理的方法（见4.3.1.2和4.3.2.3)；一“定性检查”阴性结果判定部分根据不同动物修改了需要连续检查粪便天数[见4.3.1.8b），2002年版的2.2.1.8b）］；
“定量检查”部分增加了不同动物粪便采集量以及卵囊OPG的换算方法（见4.3.2.2.4.3.2.7~4.3.2.9)；
“病理检查”中裂殖子/裂殖体检查部分增加了对免肝脏和鸭、鹅肾脏的检查（见5.3.1)；一增加了结果“综合判定部分（见第6章）；一“球虫卵囊形态特征”部分增加了不同属球虫卵囊的大小和模式图（见附录B）请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草人：董辉、黄兵、韩红玉、陈兆国、赵其平、朱顺海。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18647—2002
GB/T18647—2020
球虫病（coccidiosis)是多种动物的一种重要寄生虫病，各国均有发生，对家畜、家禽、宠物、鱼类和野生动物等均有不同程度的危害，特别在集约化养殖中，若控制不严，会造成重大经济损失。本病对家禽和兔危害较大，急性暴发的死亡率可超过30%；其次是猪、牛、羊等家畜，急性感染常引起下，生长严重受阻；犬、猫球虫病也较为常见，可引起消瘦、贫血、腹泻及生长发育受阻，严重时可导致死亡；也偶有鱼类和野生动物发生球虫病的报道。本病的病原为顶复器门（Apicomplexa）、类椎体纲（Conoidasida）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳科（Eimeriidae）中的艾美耳属（Eimeria）、等孢属（Isospora）、泰泽属（Tyzzeria）、温扬属（Wenyonella）球虫。每种动物都有各自特有的球虫种类，文献记录的畜禽和野生动物球虫种类已达2000多种。国内外对球虫病的经典诊断方法是病原检查，并结合临床症状和病理部检进行综合诊断。尽管国内外学者建立了免疫学、血清学和分子生物学等多种诊断技术，如色素试验法、子孢子制动反应、间接血凝试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞化学技术、随机引物扩增多态性DNA（RAPD)和聚合酶链式反应（PCR）等，但由于这些方法检出的准确性和操作复杂等问题，尚不能代替现有方法。
病原检查和综合诊断技术仍是目前最常用的方法。综合诊断主要用于发病或死亡后的诊断，确定动物或动物群是否因感染球虫而发病或死亡。病原检查简单、易行，既可定性，又可定量，既可用于发病前，又可用于发病后，以确定动物或动物群感染球虫的程度。病原检查可广泛用于流行病学调查、防治药物的筛选和临床验证、进出口检疫、无本病健康动物群的建立等。为了规范球虫与球虫病的检疫方法，使得检出结果客观、准确、一致，以保证《中华人民共和国动物防疫法》的实施，特制定本标准。1范围
动物球虫病诊断技术
GB/T18647—2020
本标准规定了动物球虫病的临床诊断、病原检查、病理检查、综合判定的技术要求，本标准适用于家禽（鸡、鸭、鹅等）、家畜（猪、牛、羊、马、兔等）、宠物（犬、猫等）球虫病（感染）的诊断、2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3临床诊断
根据发病临床特征，球虫病可分为急性型和慢性型急性型多发生于幼龄动物，病程初期表现为精神沉郁，嗜睡，被毛粗乱，食欲下降，腹泻。病程后期出现运动失调，食欲废绝，排出带血水样稀便，甚至是血便，具恶臭味，可视黏膜贫血、苍白，身体消瘦，甚至失重，最后因脱水、衰竭而死。慢性型多见于大龄动物无明显症状，主要表现为厌食.间歇性下痢，逐渐消瘦，生产性能下降等。有以上临床症状者，可以怀疑为球虫病，确诊需进一步进行病原或病理检查。4病原检查
4.1材料与试剂
4.1.1试剂：饱和盐水，2.5%重铬酸钾溶液，配制方法分别见附录A中A.1和A.2，配制用水符合GB/T6682—2008三级水要求
4.1.2器材：样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60目和100目铜丝网或尼龙网、100mL量筒、50mL烧杯、50mL离心管、10mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。
4.2样品菜集、保存和运输
4.2.1动物粪便的采集：对家禽、犬、猫、免等小型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于200g，若是个体采样，采集新鲜粪便不少60g；对猪、牛、羊、马等天型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于300g，若是个体采样，采集新鲜粪便不少100g。4.2.2样品的保存：样品采集后置于样品保存袋中，封口后，每份样品的包装袋上均要贴上标签，写明采集地点、采集时间、动物种类、动物年龄、粪便性状等详细资料，置于2℃～8℃冰箱内保存。4.2.3样品的运输：以最快最直接的途径将所采集的样品送往实验室进行检测，运输条件符合NY/T5412016要求。
GB/T18647—2020
4.3操作方法
4.3.1定性检查
4.3.1.1将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取10g，放入50mL烧杯中，加入适量水轻轻搅勾，经60目铜丝网或尼龙网过滤；对于猪、牛、羊、马等大型动物，滤液再经100目铜丝4.3.1.2
网或尼龙网过滤，
4.3.1.3将滤液移入50mL试管.2500r/min离心10min。4.3.1.4
瓶内。
倾去上清液，沉淀物中加人少量饱和盐水，混匀，将管内的沉淀物混悬液移人10mL玻璃用饱和盐水加满玻璃瓶，盖上盖玻片（盖玻片应与液面接触），静置10min。取下盖玻片，将有液体的一面盖在载玻片上。4.3.1.6
置载玻片于显微镜载物台上，用10×10或10×40的倍数进行检查。4.3.1.8
定性检查的判定标准如下：
发现球虫卵囊，判为阳性，说明该动物（群）已感染球虫。将球虫阳性粪样置于2.5%重铬酸钾溶液中，在25℃～28℃环境中培养至孢子化卵囊后，参见附录B球虫卵囊形态特征，确定为哪一属的球虫。
b）未发现球虫卵囊，需从4.3.1.1开始重复检查5次，仍未见球虫卵囊，该粪样可判为阴性。对于家禽、犬、猫等，需连续采集粪便7d～10d，每天检查，均未发现球虫卵囊，方可说明该动物（群）未感染球虫；而对于猪、牛、羊、马、兔等家畜.需连续采集粪便14d~21d，每天检查，均未发现球虫卵囊，说明该动物（群)未感染球虫。4.3.2定量检查
4.3.2.1对定性检查中呈阳性的粪样，需进行定量检查。4.3.2.2每份粪样取3个重复，每个重复根据待检动物种类不同取不同粪便量，家禽、犬、猫、免等小型动物取粪样2g，猪、牛、羊、马等大型动物取粪样10g，放人50mL烧杯4.3.2.3加入适量自来水搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗3次～5次滤网；对于猪、牛、羊、马等大型动物，滤液再经100目铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗3次～5次滤网。4.3.2.4将滤液移入50mL试管，2500r/min离心10min，弃去上清液。4.3.2.5用少量饱和盐水将沉淀物搅匀，移人100mL量筒，加饱和盐水至60mL处，充分混匀。4.3.2.6用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板的2个计数室，静置5min。4.3.2.7将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查，用10×10的倍数数出每个计数室（1cm×1cm×0.15cm=0.15cm)内的所有卵囊数，将两个计数室的卵囊数之和除以2即得卵囊平均值。对压线的卵囊，按左、上压线计，右、下压线不计处理。根据每个重复的卵囊平均值，计算出三个重复的平均值A。
4.3.2.8家禽、犬、猫、兔等动物的每克粪便卵囊数（oocystpergram，OPG)按式（1)计算，猪、牛、羊、马等动物的OPG按式（2)计算：
OPG=(A0.15)×60-2=A×200
OPG=(A+0.15)×60-10=A×40
4.3.2.9对卵囊数较多的粪样，可在60mL总体积的基础上，用饱和盐水再稀释B倍后计数，家禽、犬、猫、免等动物的OPG按式（3)计算，猪、牛、羊、马等动物的OPG按式（4)计算：OPG=AX200XB
OPG=AX 40 XB
定量检查的判定标准如下：
a）OPG>10×10为严重感染；
b）1×10≤0PG≤10×10+为中度感染c）OPG<1X104，为轻度感染。
5病理检查
材料准备
GB/T18647—2020
5.1.1磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见A.3.配制用水符合GB/T66822008三级水要求。5.1.2、50mL或100mL烧杯、吸管、手术剪刀、镊子、玻片、盖玻片、显微镜、研钵等。5.1.3疑为发生球虫感染致死或将要死亡的动物5.2病变检查
5.2.1对疑为球虫感染致死或将要死亡的动物进行解剖，观察病变情况。5.2.2主要检查球虫寄生部位（器官）的病变。大多数的球虫寄生于肠上皮细胞，若肠道明显肿大、胀气或变形，肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点或斑块或结节；肠内容物充满血凝块、脱落的上皮细胞、纤维素样物、黏液等，呈暗红色、橙黄色或乳白色，多为稀薄状；肠黏膜增厚，有坏死的病灶等，可疑为球虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查，5.2.3对免，还应检查肝脏；对鸭、鹅，还应检查肾脏；若这些脏器上有灰白色的斑点或斑块，可疑为球虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。5.3裂殖子/裂殖体检查
5.3.1取病变明显的肠道，纵向剪开，用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物，刮取少许黏膜；对免或鸭、鹅，还应分别刮取肝脏或肾脏灰白色的斑点或斑块5.3.2将刮取物放在载玻片上，滴1滴～2滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，置于显微镜载物台上。5.3.3在高倍镜下观察，如见有大量球形的像剥了皮的橘子似的裂殖体（直径大多为10μm～50μm）和香蕉形或月牙形的裂殖子（大小大多为5um～8um×2um～3um）.判为球虫感染5.4卵囊检查
5.4.1将病变明显的肠道，纵向剪开，取少量内容物，放在载玻片上，滴1滴～2滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，轻轻将内容物压散，置显微镜下检查，若见大量球虫卵囊（形态参见附录B)，判为球虫感染5.4.2或取有灰白色斑点或斑块的肠道，纵向剪开，用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物，刮取少许有灰白色斑的黏膜，放在载玻片上，滴1滴2滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，轻轻将黏膜内容物压散，置显微镜下检查，若见天量球虫卵囊，判为球虫感染5.4.3对疑为免或鸭、鹅的球虫病，从有灰白色斑点或斑块的肝脏或肾脏上，剪取少量病变组织，放在研钵内，加适量磷酸盐缓冲液，充分研磨。取1滴研磨液在载玻片上，加盖玻片，置显微镜下检查，若见大量球虫卵囊，判为球虫感染。6综合判定
6.1疑似
凡出现第3章的临床症状和/或符合5.2的病变特征，可判为球虫病疑似病例。6.2确诊
凡符合5.2的病变特征，并满足5.3和/或5.4中检查结果为球虫感染，或粪便定量检查结果满足4.3.2.10中a)或b)时，可判为球虫病病例。GB/T18647—2020
A.1饱和盐水配制
附录A
（规范性附录）
试剂及其配制
称取400g食盐，放人三角烧瓶中，加人1000mL水，加热烧瓶至沸腾，充分搅拌后冷却至室温，有少量盐析出，即为饱和盐水，密度约1.18g/cm。A.22.5%重铬酸钾溶液配制www.bzxz.net
称取25g重铬酸钾固体，放人1L烧杯中，加入开水至1000mL刻度处，充分搅拌使重铬酸钾完全溶解后，冷却至室温，即为2.5%重铬酸钾溶液。磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制
将下列试剂按次序加人到1000mL定量瓶中。氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
蒸馏水
充分搅匀，用适量1mol/L盐酸（HCI)调溶液的pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1L。分装至500mL或250mL的玻璃瓶中，在103.41kPa压力下蒸气灭菌20min，室温保存4
附录B
（资料性附录）
球虫卵囊形态特征
B.1球虫卵囊呈椭圆形圆形、卵圆形或梨形等不同的形态，均有卵囊壁，GB/T18647—2020
B.2未发育成熟的卵囊称为未孢子化卵囊，其颗粒状的原生质多数呈圆形，位于卵囊中间[图B.1中a。
B.3发育成熟的卵囊称为孢子化卵囊，因属不同，其内含的孢子囊和子孢子数不相同：艾美耳属（Eimeria）球虫卵囊内有4个孢子囊，每个孢子囊含2个子孢子[图B.1中b)]，卵囊a）
大小大多为（15μm~40μm）×（10μm30μm）。等孢属（Isospora）球虫卵囊内有2个孢子囊，每个孢子囊含4个子孢子[图B.1中c）].卵囊大b)
小大多为（15μm40μm）×（10μm~30μm）。泰泽属（Tyzzeria)球虫卵囊内没有孢子囊，内含8个子孢子[图B.1中d)]，卵囊大小大多为(10μm20μm）x(10μm~15μm）)。温扬属（Wenyonella）球虫卵囊内有4个孢子囊，每个孢子囊含4个子孢子［图B.1中e），卵囊d
大小大多为（15μm~30μm）×（10μm~20μm）。a）未孢子化卵囊
泰泽属孢子化卵囊
b）艾美耳属孢子化卵囊c）等孢属孢子化卵囊温扬属孢子化卵囊
不同属球虫卵囊的模式图
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