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GB/T 18647-2020

基本信息

标准号: GB/T 18647-2020

中文名称:动物球虫病诊断技术

标准类别:国家标准(GB)

标准状态:现行

出版语种:简体中文

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相关标签: 动物 球虫病 诊断 技术

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标准简介

GB/T 18647-2020.Diagnostic techniques for animal coccidiosis.
1范围
GB/T 18647规定了动物球虫病的临床诊断.病原检查.病理检查、综合判定的技术要求。
GB/T 18647适用于家禽(鸡、鸭、鹅等)、家畜(猪、牛、羊、马、兔等)、宠物(犬、猫等)球虫病(感染)的诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3临床诊断
根据发病临床特征,球虫病可分为急性型和慢性型。
急性型多发生于幼龄动物,病程初期表现为精神沉郁,嗜睡,被毛粗乱,食欲下降,腹泻。病程后期出现运动失调,食欲废绝,排出带血水样稀便,甚至是血便.具恶臭味,可视黏膜贫血、苍白,身体消瘦,甚至失重,最后因脱水、衰竭而死。
慢性型多见于大齡动物,无明显症状,主要表现为厌食,间歇性下痢.逐渐消瘦.生产性能下降等。
有以上临床症状者,可以怀疑为球虫病,确诊需进一步进行病原或病理检查。
4病原检查
4.1材料与试剂
4.1.1试剂: 饱和盐水,2.5%重铬酸钾溶液,配制方法分别见附录A中A.1和A.2,配制用水符合GB/T 6682-2008 三级水要求。
4.1.2 器材:样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60目和100目铜丝网或尼龙网、100 mL量筒、50 mL烧杯、50 mL离心管、10 mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。

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标准内容

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18647—2020
代替GB/T18647—2002
动物球虫病诊断技术
Diagnostic techniques for animal coccidiosis2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T18647—2020
本标准代替GB/T18647—2002《动物球虫病诊断技术》。本标准与GB/T18647—2002相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下:一“范围”部分增加了家畜(猪、牛、羊、马等)和宠物(犬、猫等)(见第1章):增加了“临床诊断”部分(见第3章);—“病原检查”部分增加了“样品采集、保存和运输”(见4.2);“定性检查”和“定量检查”部分增加了不同动物粪便处理的方法(见4.3.1.2和4.3.2.3);一“定性检查”阴性结果判定部分根据不同动物修改了需要连续检查粪便天数[见4.3.1.8b),2002年版的2.2.1.8b)];
“定量检查”部分增加了不同动物粪便采集量以及卵囊OPG的换算方法(见4.3.2.2.4.3.2.7~4.3.2.9);
“病理检查”中裂殖子/裂殖体检查部分增加了对免肝脏和鸭、鹅肾脏的检查(见5.3.1);一增加了结果“综合判定部分(见第6章);一“球虫卵囊形态特征”部分增加了不同属球虫卵囊的大小和模式图(见附录B)请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草人:董辉、黄兵、韩红玉、陈兆国、赵其平、朱顺海。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T18647—2002
GB/T18647—2020
球虫病(coccidiosis)是多种动物的一种重要寄生虫病,各国均有发生,对家畜、家禽、宠物、鱼类和野生动物等均有不同程度的危害,特别在集约化养殖中,若控制不严,会造成重大经济损失。本病对家禽和兔危害较大,急性暴发的死亡率可超过30%;其次是猪、牛、羊等家畜,急性感染常引起下,生长严重受阻;犬、猫球虫病也较为常见,可引起消瘦、贫血、腹泻及生长发育受阻,严重时可导致死亡;也偶有鱼类和野生动物发生球虫病的报道。本病的病原为顶复器门(Apicomplexa)、类椎体纲(Conoidasida)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美耳科(Eimeriidae)中的艾美耳属(Eimeria)、等孢属(Isospora)、泰泽属(Tyzzeria)、温扬属(Wenyonella)球虫。每种动物都有各自特有的球虫种类,文献记录的畜禽和野生动物球虫种类已达2000多种。国内外对球虫病的经典诊断方法是病原检查,并结合临床症状和病理部检进行综合诊断。尽管国内外学者建立了免疫学、血清学和分子生物学等多种诊断技术,如色素试验法、子孢子制动反应、间接血凝试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫细胞化学技术、随机引物扩增多态性DNA(RAPD)和聚合酶链式反应(PCR)等,但由于这些方法检出的准确性和操作复杂等问题,尚不能代替现有方法。
病原检查和综合诊断技术仍是目前最常用的方法。综合诊断主要用于发病或死亡后的诊断,确定动物或动物群是否因感染球虫而发病或死亡。病原检查简单、易行,既可定性,又可定量,既可用于发病前,又可用于发病后,以确定动物或动物群感染球虫的程度。病原检查可广泛用于流行病学调查、防治药物的筛选和临床验证、进出口检疫、无本病健康动物群的建立等。为了规范球虫与球虫病的检疫方法,使得检出结果客观、准确、一致,以保证《中华人民共和国动物防疫法》的实施,特制定本标准。1范围
动物球虫病诊断技术
GB/T18647—2020
本标准规定了动物球虫病的临床诊断、病原检查、病理检查、综合判定的技术要求,本标准适用于家禽(鸡、鸭、鹅等)、家畜(猪、牛、羊、马、兔等)、宠物(犬、猫等)球虫病(感染)的诊断、2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3临床诊断
根据发病临床特征,球虫病可分为急性型和慢性型急性型多发生于幼龄动物,病程初期表现为精神沉郁,嗜睡,被毛粗乱,食欲下降,腹泻。病程后期出现运动失调,食欲废绝,排出带血水样稀便,甚至是血便,具恶臭味,可视黏膜贫血、苍白,身体消瘦,甚至失重,最后因脱水、衰竭而死。慢性型多见于大龄动物无明显症状,主要表现为厌食.间歇性下痢,逐渐消瘦,生产性能下降等。有以上临床症状者,可以怀疑为球虫病,确诊需进一步进行病原或病理检查。4病原检查
4.1材料与试剂
4.1.1试剂:饱和盐水,2.5%重铬酸钾溶液,配制方法分别见附录A中A.1和A.2,配制用水符合GB/T6682—2008三级水要求
4.1.2器材:样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60目和100目铜丝网或尼龙网、100mL量筒、50mL烧杯、50mL离心管、10mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微镜等。
4.2样品菜集、保存和运输
4.2.1动物粪便的采集:对家禽、犬、猫、免等小型动物,若是群体采样,采集新鲜粪便不少于200g,若是个体采样,采集新鲜粪便不少60g;对猪、牛、羊、马等天型动物,若是群体采样,采集新鲜粪便不少于300g,若是个体采样,采集新鲜粪便不少100g。4.2.2样品的保存:样品采集后置于样品保存袋中,封口后,每份样品的包装袋上均要贴上标签,写明采集地点、采集时间、动物种类、动物年龄、粪便性状等详细资料,置于2℃~8℃冰箱内保存。4.2.3样品的运输:以最快最直接的途径将所采集的样品送往实验室进行检测,运输条件符合NY/T5412016要求。
GB/T18647—2020
4.3操作方法
4.3.1定性检查
4.3.1.1将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取10g,放入50mL烧杯中,加入适量水轻轻搅勾,经60目铜丝网或尼龙网过滤;对于猪、牛、羊、马等大型动物,滤液再经100目铜丝4.3.1.2
网或尼龙网过滤,
4.3.1.3将滤液移入50mL试管.2500r/min离心10min。4.3.1.4
瓶内。
倾去上清液,沉淀物中加人少量饱和盐水,混匀,将管内的沉淀物混悬液移人10mL玻璃用饱和盐水加满玻璃瓶,盖上盖玻片(盖玻片应与液面接触),静置10min。取下盖玻片,将有液体的一面盖在载玻片上。4.3.1.6
置载玻片于显微镜载物台上,用10×10或10×40的倍数进行检查。4.3.1.8
定性检查的判定标准如下:
发现球虫卵囊,判为阳性,说明该动物(群)已感染球虫。将球虫阳性粪样置于2.5%重铬酸钾溶液中,在25℃~28℃环境中培养至孢子化卵囊后,参见附录B球虫卵囊形态特征,确定为哪一属的球虫。
b)未发现球虫卵囊,需从4.3.1.1开始重复检查5次,仍未见球虫卵囊,该粪样可判为阴性。对于家禽、犬、猫等,需连续采集粪便7d~10d,每天检查,均未发现球虫卵囊,方可说明该动物(群)未感染球虫;而对于猪、牛、羊、马、兔等家畜.需连续采集粪便14d~21d,每天检查,均未发现球虫卵囊,说明该动物(群)未感染球虫。4.3.2定量检查
4.3.2.1对定性检查中呈阳性的粪样,需进行定量检查。4.3.2.2每份粪样取3个重复,每个重复根据待检动物种类不同取不同粪便量,家禽、犬、猫、免等小型动物取粪样2g,猪、牛、羊、马等大型动物取粪样10g,放人50mL烧杯4.3.2.3加入适量自来水搅匀,经60目铜丝网或尼龙网过滤,用少量自来水冲洗3次~5次滤网;对于猪、牛、羊、马等大型动物,滤液再经100目铜丝网或尼龙网过滤,用少量自来水冲洗3次~5次滤网。4.3.2.4将滤液移入50mL试管,2500r/min离心10min,弃去上清液。4.3.2.5用少量饱和盐水将沉淀物搅匀,移人100mL量筒,加饱和盐水至60mL处,充分混匀。4.3.2.6用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板的2个计数室,静置5min。4.3.2.7将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查,用10×10的倍数数出每个计数室(1cm×1cm×0.15cm=0.15cm)内的所有卵囊数,将两个计数室的卵囊数之和除以2即得卵囊平均值。对压线的卵囊,按左、上压线计,右、下压线不计处理。根据每个重复的卵囊平均值,计算出三个重复的平均值A。
4.3.2.8家禽、犬、猫、兔等动物的每克粪便卵囊数(oocystpergram,OPG)按式(1)计算,猪、牛、羊、马等动物的OPG按式(2)计算:
OPG=(A0.15)×60-2=A×200
OPG=(A+0.15)×60-10=A×40
4.3.2.9对卵囊数较多的粪样,可在60mL总体积的基础上,用饱和盐水再稀释B倍后计数,家禽、犬、猫、免等动物的OPG按式(3)计算,猪、牛、羊、马等动物的OPG按式(4)计算:OPG=AX200XB
OPG=AX 40 XB
定量检查的判定标准如下:
a)OPG>10×10为严重感染;
b)1×10≤0PG≤10×10+为中度感染c)OPG<1X104,为轻度感染。
5病理检查
材料准备
GB/T18647—2020
5.1.1磷酸盐缓冲液(PBS),配制方法见A.3.配制用水符合GB/T66822008三级水要求。5.1.2、50mL或100mL烧杯、吸管、手术剪刀、镊子、玻片、盖玻片、显微镜、研钵等。5.1.3疑为发生球虫感染致死或将要死亡的动物5.2病变检查
5.2.1对疑为球虫感染致死或将要死亡的动物进行解剖,观察病变情况。5.2.2主要检查球虫寄生部位(器官)的病变。大多数的球虫寄生于肠上皮细胞,若肠道明显肿大、胀气或变形,肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点或斑块或结节;肠内容物充满血凝块、脱落的上皮细胞、纤维素样物、黏液等,呈暗红色、橙黄色或乳白色,多为稀薄状;肠黏膜增厚,有坏死的病灶等,可疑为球虫病,进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查,5.2.3对免,还应检查肝脏;对鸭、鹅,还应检查肾脏;若这些脏器上有灰白色的斑点或斑块,可疑为球虫病,进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。5.3裂殖子/裂殖体检查
5.3.1取病变明显的肠道,纵向剪开,用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物,刮取少许黏膜;对免或鸭、鹅,还应分别刮取肝脏或肾脏灰白色的斑点或斑块5.3.2将刮取物放在载玻片上,滴1滴~2滴磷酸盐缓冲液,加盖玻片,置于显微镜载物台上。5.3.3在高倍镜下观察,如见有大量球形的像剥了皮的橘子似的裂殖体(直径大多为10μm~50μm)和香蕉形或月牙形的裂殖子(大小大多为5um~8um×2um~3um).判为球虫感染5.4卵囊检查
5.4.1将病变明显的肠道,纵向剪开,取少量内容物,放在载玻片上,滴1滴~2滴磷酸盐缓冲液,加盖玻片,轻轻将内容物压散,置显微镜下检查,若见大量球虫卵囊(形态参见附录B),判为球虫感染5.4.2或取有灰白色斑点或斑块的肠道,纵向剪开,用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物,刮取少许有灰白色斑的黏膜,放在载玻片上,滴1滴2滴磷酸盐缓冲液,加盖玻片,轻轻将黏膜内容物压散,置显微镜下检查,若见天量球虫卵囊,判为球虫感染5.4.3对疑为免或鸭、鹅的球虫病,从有灰白色斑点或斑块的肝脏或肾脏上,剪取少量病变组织,放在研钵内,加适量磷酸盐缓冲液,充分研磨。取1滴研磨液在载玻片上,加盖玻片,置显微镜下检查,若见大量球虫卵囊,判为球虫感染。6综合判定
6.1疑似
凡出现第3章的临床症状和/或符合5.2的病变特征,可判为球虫病疑似病例。6.2确诊
凡符合5.2的病变特征,并满足5.3和/或5.4中检查结果为球虫感染,或粪便定量检查结果满足4.3.2.10中a)或b)时,可判为球虫病病例。GB/T18647—2020
A.1饱和盐水配制
附录A
(规范性附录)
试剂及其配制
称取400g食盐,放人三角烧瓶中,加人1000mL水,加热烧瓶至沸腾,充分搅拌后冷却至室温,有少量盐析出,即为饱和盐水,密度约1.18g/cm。A.22.5%重铬酸钾溶液配制
称取25g重铬酸钾固体,放人1L烧杯中,加入开水至1000mL刻度处,充分搅拌使重铬酸钾完全溶解后,冷却至室温,即为2.5%重铬酸钾溶液。磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制
将下列试剂按次序加人到1000mL定量瓶中。氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
蒸馏水
充分搅匀,用适量1mol/L盐酸(HCI)调溶液的pH值至7.4,再加蒸馏水定容至1L。分装至500mL或250mL的玻璃瓶中,在103.41kPa压力下蒸气灭菌20min,室温保存4
附录B
(资料性附录)
球虫卵囊形态特征
B.1球虫卵囊呈椭圆形圆形、卵圆形或梨形等不同的形态,均有卵囊壁,GB/T18647—2020
B.2未发育成熟的卵囊称为未孢子化卵囊,其颗粒状的原生质多数呈圆形,位于卵囊中间[图B.1中a。
B.3发育成熟的卵囊称为孢子化卵囊,因属不同,其内含的孢子囊和子孢子数不相同:艾美耳属(Eimeria)球虫卵囊内有4个孢子囊,每个孢子囊含2个子孢子[图B.1中b)],卵囊a)
大小大多为(15μm~40μm)×(10μm30μm)。等孢属(Isospora)球虫卵囊内有2个孢子囊,每个孢子囊含4个子孢子[图B.1中c)].卵囊大b)
小大多为(15μm40μm)×(10μm~30μm)。泰泽属(Tyzzeria)球虫卵囊内没有孢子囊,内含8个子孢子[图B.1中d)],卵囊大小大多为(10μm20μm)x(10μm~15μm))。温扬属(Wenyonella)球虫卵囊内有4个孢子囊,每个孢子囊含4个子孢子[图B.1中e),卵囊d
大小大多为(15μm~30μm)×(10μm~20μm)。a)未孢子化卵囊
泰泽属孢子化卵囊免费标准bzxz.net
b)艾美耳属孢子化卵囊c)等孢属孢子化卵囊温扬属孢子化卵囊
不同属球虫卵囊的模式图
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