SN/T4876.1—2017 DNA条形码方法 第1部分：检疫性乳白蚁 前言 本部分为SN/T4876《DNA条形码方法》系列标准的第1部分。本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张卫东、权永兵、许彩芸、钱路、黄永辉、迟远丽、徐浪、廖力、徐森锋、余道坚、安榆林、王振华。 1 范围 SN/T4876的本部分规定了我国检疫性乳白蚁的DNA条形码检测方法。本部分适用于我国进境植物检疫性乳白蚁DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1105 大家白蚁检疫鉴定方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 (DNA barcodes)：一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。 3.2 凭证标本 (voucher specimens)：DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。 3.3 COI基因：线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunit I)，由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。 4 乳白蚁基本信息 中文名称：乳白蚁 学名：Coptotermes spp. 分类地位：等翅目 Isoptera，鼻白蚁科 Rhinotermitidae，乳白蚁属 Coptotermes Wasmann。乳白蚁属是世界性的重要害虫种之一，目前全世界有效定名的乳白蚁近70种。主要危害房屋建筑中的木结构，也危害埋地塑料和绿化树木。乳白蚁近距离传播靠成虫飞行扩散，远距离传播主要借助于原木、板材、木方及木质包装等铺垫材料等扩散。 5 方法原理 根据乳白蚁的COI序列特征，应用DNA条形码技术对乳白蚁进行鉴定。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备与用具 常规PCR仪、微量分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、酸度计、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、解剖镜、天平、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、-70℃冰箱、冰箱、微量移液器（0.5μL, 2μL, 10μL, 20μL, 100μL, 200μL, 1000μL）、PCR反应管（0.2mL, 0.5mL)。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液（含1% SDS、50mmol/L Tris-HCl、25mmol/L NaCl、25mmol/L EDTA）、3mmol/L KOAc (pH 7.2)、Tris饱和酚、蛋白酶K、氰仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、RNase A、10×PCR缓冲液、DL2000 Marker、琼脂糖、溴化乙锭、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Tag DNA聚合酶、引物（见表1）、EB缓冲液。 表1 扩增引物 目标基因：COI 引物：TY-F (5'-GTGCATTAAGC-3'), TY-R (5'-CTTGCTTTCAGTCATCTGATG-3') 扩增片段大小/bp：763 7 DNA条形码鉴定 7.1 样品的处理 样品的处理见SN/T1105。尽可能选择新鲜标本，标本保存于无水乙醇中，每份标本单管保存，并做好唯一性标识。 7.2 核酸的制备 取白蚁于双蒸水中漂洗，吸水纸吸干，解剖镜下剔除腹部，取胸部肌肉和足置于1.5mL Eppendorf管中，加入40μL提取液（含1% SDS、50mmol/L Tris·HCl、25mmol/L NaCl、25mmol/L EDTA），放置于-70℃冰箱中，4min后取出，用牙签捣碎，勾浆，加入等体积的3mmol/L...