SN/T 3567.10-2017.Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 10: Anthracnose.
1范围
SN/T 3567.10规定了国境口岸炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3567.10适用于炭疽芽孢杆菌筛查检测,以及对国境口岸感染炭疽芽孢杆菌或疑似被炭疽芽孢杆菌污染的物品实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
SN/T 1214- 2003国境 口岸处理炭疽杆菌污染可疑物品操作规程
SN/T 2358- -2009国境 口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录(卫生部2006)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1交叉引物恒温扩增技术crossing priming isothermal amplification;CPA
一种核酸恒温扩增技术,CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶(DNAPoly-merase )外,还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性,使脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid,DNA)的循环扩增能不断的实现。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3567.10—2017
交叉引物恒温扩增检测方法
第10部分：炭疽芽孢杆菌
Detectionmethod of crossingprimingisothermalamplification-Part 10:Anthracnose
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：霍乱弧菌；
第3部分：大肠杆菌0157：H7；
第4部分：黄热病毒；
一第5部分：沙门菌属；
第6部分：结核分枝杆菌；
第7部分：肠道病毒71型；
第8部分：症原虫；
第9部分：鼠疫耶尔森菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：志贺菌。
本部分为SN/T3567的第10部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3567.10—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：王馨、翰文东、赵辉、原静、李浩辰、祁军、胡林、尤其敏。I
1范围
交叉引物恒温扩增检测方法
第10部分：炭疽芽孢杆菌
SN/T3567.10—2017
SN/T3567的本部分规定了国境口岸炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果的报告。
本部分适用于炭疽芽孢杆菌筛查检测，以及对国境口岸感染炭疽芽孢杆菌或疑似被炭疽芽孢杆菌污染的物品实验室检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1214—2003国境口岸处理炭疽杆菌污染可疑物品操作规程国境口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法SN/T2358—2009
人间传染的病原微生物名录（卫生部2006）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
crossingprimingisothermalamplification;CPA交叉引物恒温扩增技术
一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶（DNAPolymerase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核首酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid,DNA）的循环扩增能不断的实现。3.2
crossingprimer
交叉引物
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5未端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.3
剥离引物bumperprimer
位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。
检测引物detectionprimer
一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标SN/T3567.10—2017
记，以用于检测。
BstDNA聚合酶BstDNApolymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'-→3'DNA聚合酶活性，但是去除了5→3'核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（StrandDisplacement)。
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006)中的有关规定，应由具备相关资格的工作人员进行实验操作。所有废弃物也应按照GB19489中的有关规定执行。
6检测对象
炭疽芽孢杆菌菌株。
疑似感染炭疽芽孢杆菌的病人和被污染物品。6.2
试剂和材料
除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。DNA提取试剂：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。10×ThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8）、100mmol/L(NH,)2SO、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。10mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。7.4
BstDNA聚合酶：8U/μL。
甜菜碱溶液：5mol/L。
MgSO溶液：100mmol/L。
阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。阴性对照：DNA提取试剂。
0TE缓冲液（pH7.4)：0.1mol/LTris-HCl（pH7.2)20mL加人0.5mol/LEDTA（pH8.0）7.10
4.0mL，用超纯水定容至200mL。高压灭菌后4℃保存。7.112%琼脂糖凝胶
2Goldview:0.5μg/μL。
3DNA分子标记物，
7.14引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。参见附录A。7.15
5封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）：使用方法参见附录B。仪器设备
任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。SN/T3567.10—2017
微量移液器：量程范围为0.1μL~2μL；0.5μL~10μL；10μL~100μL;100μL~1000μL。计时器。
超净工作台。
生物安全柜。
消毒灭菌锅。
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。
低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。
紫外凝胶电泳图像分析系统。
炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增法检测程序9
样品菜集和处理
按照SN/T2358—2009、SN/T1214—2003执行样本采集和处理。9.2
模板DNA提取
9.2.1煮沸法
按照SN/T2358—2009进行DNA提取试剂盒提取
按适用于炭疽芽孢杆菌基因组提取的试剂盒说明书操作。交叉引物恒温扩增
9.3.1交叉引物恒温扩增引物
用于检测炭疽芽孢杆菌的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。9.3.2阳性对照、阴性对照和空白对照设置实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引物恒温扩增模板；阴性对照采用DNA提取液作为交叉引物恒温扩增模板；空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板。9.3.3
3交叉引物恒温扩增反应体系
交叉引物恒温扩增反应检测炭疽芽孢杆菌的参考反应体系见表1。3
SN/T3567.10—2017
试剂名称
10×ThermoPol缓冲液
10 mmol/L dNTPs
剥离引物F和R
交叉扩增引物F和R
检测引物F和 R
甜菜碱
BstDNA聚合酶
表1炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增反应体系储备液浓度
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
20μmol/L
100mmol/L
5mol/L
8U/μL
50ng/μl
交叉引物恒温扩增反应程序
将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min9.3.5
交叉引物恒温扩增产物检测
20μL体系加样量
各0.1μL
各0.8μL
各0.3μL
补足反应体系至20μL
扩增产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶电泳图像分析系统下观察分析扩增产物。9.3.5.1
9.3.5.2可使用但不限于通过封闭式-次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测交叉引物恒温扩增产物，该方法灵敏度较高，且可降低交叉污染的风险。具体操作步骤参见B.1。9.3.6
检测结果判定
电泳产生梯形条带判定为交叉引物恒温扩增检测阳性。9.3.6.1
置方法的结果描述及判定参见B.3。可使用封闭式一次性核酸检测装9.3.6.2
剥离引物
BA16SF3
BA16SR3
交叉引物
BA16SCPR
BA16SCPF
检测引物
BA16SFITC
BA16SBiotin
（资料性附录）
炭疽芽孢杆菌CPA检测的引物序列5-GGCTTCGGCTGTCACTTA
5-GTTGCTCCGTCAGACTTT
SN/T3567.10—2017
5-GTAACGGCTCACCAAGGCTACTGCTGCCTCCCGTA5-CTACTGCTGCCTCCCGTAGTAACGGCTCACCAAGG5-FITC-GTAACGGCTCACCAAGGbzxZ.net
5-BIOTIN-CACACTGGGACTGAGACACS
SN/T3567.10—2017
附录B
（资料性附录）
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）B.1操作步骤及操作示意图
B.1.1将扩增后的反应管（不可开盖，以避免污染）放人封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条)的固定盒（内芯)中，合上固定盒后将其装人装置外盒B.1.2按手柄至检测装置于关闭状态（听见清脆的“味嗪”声）。B.1.3将检测装置放置在操作台上，请通过阅读窗判读结果。15min～30min为最佳判读时间，但不应超过2h。
B.1.4记录检测结果，丢弃检测装置在安全处。B.1.5操作示意图见图B.1。
将扩增后未打开的PCR管
放入固定盒
合上手柄盖
质控方法
阴性对照仅出现一条红线（在质控区C）图B.1
合上固定盒
将固定盒插入外盒
压紧手柄盖并扣死
阳性对照出现两条红线：一条位于检测区（T)，另一条位于质控区(C)。每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。判读结果
3结果描述及判定
SN/T3567.10-2017
仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无待测病原体；或其拷贝数低于该检测试剂的最低检B.3.1
测限。
出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在待测病原体或基因。将检测线强度与色卡进行对照：≥L4，为阳性；无效。
检测结果判读示意图
检测结果判读示意图见图B.2。
质控线(C)
检测线(T)
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