SN/T 3437-2012.Detection and identification of potato spindle tuber viroid.
1范围
SN/T 3437规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(potatospindletuberviroid)的检疫鉴定方法。
SN/T 3437适用于检测可能带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯脱毒苗、试管苗、种薯、商品薯、大田中生长的马铃薯及收获后的块茎、番茄、鳄梨、人参果等其他寄主。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3原理
3.1马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息
种名:potato spindle tuber viroid
缩写:PSTVd
异名: potato spindle tuber virus, potato gothic virus, tomato bunchy top virus.
分类:马铃薯纺锤块茎类病毒科(familypospiviroidae),马铃薯纺锤块茎类病毒属(GenusPospivir-oid)。
马铃薯纺锤块茎类病毒的其他信息参见附录A。
3.2检疫 鉴定依据
PSTVd的基因组特征和在寄主植物上的症状特征是检疫鉴定的依据。PSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子,这种环状的RNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多。依据基因组特征建立往返聚丙烯酰胺凝胶电泳( Return- Polyacrylamide Gel Electrophoresis, R- PAGE) .RT-PCR .实时荧光RT-PCR(Real-time PCR)检测方法,这些方法结合寄主
植物症状的有无和症状特征(参见附录A),判断样品是否带有PSTVd。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3437—2012
马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of potato spindle tuber viroid2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3437—2012
本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所。本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、陈红运、吕典秋、邱彩玲、张洪祥、王振华、杨立群、刘尚武。I
1范围
马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法SN/T3437—2012
本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（potatospindletuberviroid)的检疫鉴定方法。本标准适用于检测可能带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯脱毒苗、试管苗、种薯、商品薯、大田中生长的马铃薯及收获后的块茎、番茄、鳄梨、人参果等其他寄主2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
3.1马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息种名：potatospindletuberviroid缩写：PSTVd
异名：potato spindletubervirus.potato gothic virusomatobunchy
topvirus
分类：马铃薯纺锤块茎类病毒科（familypospiviroidae)，马铃薯纺锤块茎类病毒属（GenusPospiviroid)。
马铃薯纺锤块茎类病毒的其他信息参见附录A2检疫鉴定依据
PSTVd的基因组特征和在寄主植物上的症状特征是检疫鉴定的依据。PSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子，这种环状的RNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多。依据基因组特征建立往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-PolyacrylamideGelElectrophoresis，R-PAGE）、RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-timePCR）检测方法，这些方法结合寄主植物症状的有无和症状特征（参见附录A)，判断样品是否带有PSTVd。4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、冷藏冷冻冰箱、电子天平、涡旋振荡器、烘箱等。1
SN/T3437-—2012
4.2用具
可调移液器（0.1μ~2.5μ，2μ~20μ10μ~100μ20μ200μ，100μ~1000μ）和可调移液器头、离心管、研钵、微型磨杆。4.3试剂
主要试剂见附录B、附录C、附录D。5
检疫鉴定
检测方法的选择及检测鉴定的流程5.1
本标准采用RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-timePCR）、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-PolyacrylamideGelElectrophoresis，R-PAGE)检测方法。检测流程见图1、图2。进口脱毒苗、试管苗
隔离种植，症状检查
初级检测
(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR)阴性结果
无症状
PSTVd阴性
有症状
阳性结果
二级检测试验方法
有症状
有症状
(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR)进口种薯、商品薯bzxZ.net
初级检测
(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR)阴性结果
无症状
PSTVd阴性
阳性结果
阳性结果
样品带有
进口马铃薯种薯、商品薯、脱毒苗和试管苗系统检测确认PSTVd存在与否的判定方案PSTVd阳性
有症状
大田植株、收获后的块茎
初级检测
(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR）阳性结果
无症状
二级检测试验方法
（R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR）阳性结果
样品带有
有症状
阴性结果
无症状
PSTVd阴性
SN/T3437—2012
图2收获后的块茎或收获前大田植株系统检测确认PSTVd存在与否的判定方案5.2隔离种植及症状检查
所有进境的脱毒苗、种苗等各类可繁殖的马铃薯材料都需要按有关要求隔离种植，生长温度应至少高于18℃（更适宜的温度是高于20℃)和至少16h的光周期。在生长期间进行严格的症状检查。仔细检查马铃薯植株是否有可疑症状，在花期或接近花期时，采集有可疑症状的植株叶片，进行室内检测，如果没有发现任何可疑症状，可随机取样。对于进境的种薯可在隔离种植前对块茎进行症状检查，并取样，取样标准按照SN/T2122的规定执行。按流程做室内检测。对于产地检疫，可在花期或接近花期的生产田调查采样，也可采集收获后的薯块样品。症状检查可参见附录A。5.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分别提取样品和对照的总RNA，进行往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，健康的植物组织作阴性对照，感染PSTVd的植物组织作阳性对照，用DEPC水作空白对照。方法见附录B。
5.4RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染PSTVd的植物组织作阳性对照，用DEPC水作空白对照。3
SN/T3437—2012
具体操作见附录C。
实时荧光RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染PSTVd的植物组织作阳性对照，用DEPC水作空白对照。具体操作见附录D。
6结果判定
6.1脱毒苗与试管苗在隔离种植期间观察到可疑症状植株，经5.3、5.4、5.5中的任一种方法检测为阳性，则判断样品带有PSTVd；生长期间无症状植株样品，经单一方法检测结果为阳性，需不同方法再确认一次，两次结果都为阳性，则判断样品带有PSTVd。6.2大田植株和收获后的块茎不需隔离种植，检测结果判断方法相同，6.3针对番茄、鳄梨、人参果等其他寄主的结果判定，需对阳性RT-PCR产物进行序列测定，并和已知PSTVd株系的序列比对，序列和已知株系一致时则判断样品带有PSTVd
7样品保存
结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；往返聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色结果图片、RT-PCR检测电泳结果图片、实时荧光RT-PCR检测结果图片。
7.2样品保存
样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于0℃冰箱保存1年，保存的样品要做好标记和登记保存期满后，需经灭活处理。
工作，以备复验、谈判和仲裁。A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯纺锤块茎类病毒相关资料SN/T3437—2012
自然寄主有马铃薯（Solanumtuberosum）、番茄（LycopersiciEsculentum）、鳄梨（Perseaamericana）、人参果（solanummuricatum）、曼陀罗（Brugmansiasp）、素馨叶白英（Solanumjasminoides）、蓝花茄（S.rantonnetii）、果酱木（Streptosolenjamesonii）和灯笼果（Physalisperuviana）。人工接种寄主比较广泛，能感染31属94种。
鉴别寄主：常用的鉴别寄主有鲁特格尔斯番茄（LycopersiconesculentumcvRutgers）和食若(Scopoliasinensis)。
A.2地理分布
北美洲：美国（堪萨斯、缅因、马里兰、密西根、纽约、威斯康星），加拿大（阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦斯维克、安大略、爱德华岛、魁北克）欧洲：捷克、法国、德国、匈牙利、荷兰南美洲：阿根廷、乌拉圭、巴西、秘鲁、古巴非洲：南非、尼日利亚。
、斯洛伐克、瑞士
亚洲：阿富汗、印度、日本、中国（河北、黑龙江江苏）
大洋洲：澳大利亚，新南威尔土，维多利亚。A.3传播途径
土耳其、英国、苏格兰、前苏联。PSTVd可以通过机械接触
独、汁液接种及被感染的农机具、农民的衣物进行传播。此外，采用块茎生产繁殖时，如果切取块茎的切刀被污染也可传播该类病毒。咀嚼式昆虫的传播已有报道，但还未定论。当PSTVd和马铃薯卷叶病毒（potatoleafrollvirus.PLRV混合侵染时，PSTVd可通过蚜虫传播。实生种子也是传播该类病毒的主要途径。远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易。A.4基因组特征
PSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子，这种环状的RNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同分子量的线状分子要慢得多。PSTVd通常含有359个核苷酸，偶尔有358或360个核昔酸。在种野生的茄属和西红柿中发现含356个核苷酸的PSTVd，在人参果中有356和357个核苷酸的PSTVd，各分离物在同源性上差异很小。A.5寄主症状
PSTVd侵染马铃薯引起的症状表现与类病毒株系、栽培品种品系及环境条件有关，PSTVd可以引5
SN/T3437—2012
起植株矮化，茎秆直立僵硬，叶片叶柄与主茎的夹角变小，呈半闭半合状和扭曲，叶片叶柄常呈锐角形态向上竖起。有的全株失去润泽的绿色，有的从上方观察叶子是暗绿色和皱缩的；有的顶部叶片变小、卷曲、算立，有的感病植株不表现症状（见图A.1）。块茎变小，畸形，有的顶端变尖，圆形的块茎变长，有的表面开裂，有的芽眼突出，典型的块茎症状为纺锤形或哑铃形（见图A.2、图A.3、图A.4）。注：感病植株症状表现为束顶，叶片失绿变黄，植株僵硬感染PSTVd马铃薯植株症状（中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局提供）图A.1
注：从左向右三个块茎是感染PSTVd的症状，表现为纺锤形；最右边的一个块茎是健康对照。图A.2感染PSTVd的马铃薯块茎
（引自EPPOStandardsPM7/33.potatospindletuberpospiviroid)HEALTHY
NORGOLDRUSSET
注：感病的块茎症状表现为纺锤形、畸形、龟裂。HEALTHY
ACHIPPER
SN/T3437—2012
图A.3感染PSTVd的马铃薯块茎
（引自EPPOStandardsPM7/33.potatospindletuberpospiviroid）注：左边为感染PSTVd的块茎，表现症状为龟裂、纺锤形、畸形，右边为健康块茎。图A.4感染PSTVd的马铃薯块茎（黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供）
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