SN/T 4853.3-2017
基本信息
标准号： SN/T 4853.3-2017
中文名称：转基因大米定量检测数字PCR法第3部分:科丰6号品系
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4853.3-2017.Quantitative detection of genetically modified rice-Digital PCR-Part 3:Event KF6.
1范围
SN/T 4853.3规定了稻谷和大米中科丰6号品系的数字PCR定量检测方法。
SN/T 4853.3适用于稻谷和大米中科丰6号品系特异性的数字PCR定量检测。
SN/T 4853.3的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1转基因产 品检测通用要求和定 义
GB/T 19495.2转 基因产品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转 基因产品检测核酸 提取纯化方法
GB/T 19495.5转基因产品检测核酸定量 PCR检测方法
GB/T 19495.7转基因产品检测 抽样 和制样方法
SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 SPS基因The gene of sucrose phosphate synthase
蔗糖磷酸合成酶基因,大米单拷贝内参照基因。
3.1.2 科丰6号转化体特异性序列event-specific sequence of KF6
外源DNA插人受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。
3.1.3 Taq酶Taq DNA polymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
1范围
SN/T 4853.3规定了稻谷和大米中科丰6号品系的数字PCR定量检测方法。
SN/T 4853.3适用于稻谷和大米中科丰6号品系特异性的数字PCR定量检测。
SN/T 4853.3的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1转基因产 品检测通用要求和定 义
GB/T 19495.2转 基因产品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转 基因产品检测核酸 提取纯化方法
GB/T 19495.5转基因产品检测核酸定量 PCR检测方法
GB/T 19495.7转基因产品检测 抽样 和制样方法
SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 SPS基因The gene of sucrose phosphate synthase
蔗糖磷酸合成酶基因,大米单拷贝内参照基因。
3.1.2 科丰6号转化体特异性序列event-specific sequence of KF6
外源DNA插人受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。
3.1.3 Taq酶Taq DNA polymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4853.3—2017
转基因大米定量检测
数字PCR法
第3部分：科丰6号品系
Quantitative detection of genetically modified riceDigital PCR-Part3:EventKF6
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4853《转基因大米定量检测第1部分：TT51-1品系；
第2部分：克稻品系；
第3部分：科丰6号品系；
—第4部分：M12品系；
第5部分：LL62品系；
—第6部分：T2A-1品系；
-第7部分：T1C-19品系。
数字PCR法》系列标准共分为7部分：本部分为SN/T4853标准的第3部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4853.3-—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：黄文胜、陈颖、邓婷婷、吴亚君、付伟、聂丹丹、朱水芳、韩建勋、李想。I
1范围
数字PCR法
转基因大米定量检测
第3部分：科丰6号品系
本部分规定了稻谷和大米中科丰6号品系的数字PCR定量检测方法。本部分适用于稻谷和大米中科丰6号品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。2规范性引用文件
SN/T4853.3—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.1
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3
转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5
GB/T19495.7
转基因产品检测
转基因产品检测
核酸定量PCR检测方法
抽样和制样方法
SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
SPS基因Thegene of sucrosephosphate synthase蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。3.1.2
event-specificsequenceofKF6
科丰6号转化体特异性序列
外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。3.1.3
Taq酶TaqDNApolymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。3.1.4
template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。SN/T4853.3—2017
定量检测低限limitofquantification；LoQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。3.1.6
qualitycontrol sample
质控样品
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA。3.1.7
微反应体系
tinyreactionsystem
将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。3.1.8
文Conversionfactor
转换系数
将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（质量分数)时所用系数。3.1.9
fFluorescentlytaggedprobe
荧光标记探针
在5'末端和3'末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5'-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）bp：碱基对（basepair）
NC：阴性对照（negaitivecontrol）NTC：空白对照（notemplatecontrol）PC：阳性对照（positivecontrol）4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecificsequence）和内参照基因（speciesspecificgene)的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。2
仪器和设备
超纯水发生器（分子生物学级别）。分析天平：感量0.1g和0.1mg。
6.3生物安全柜。
PCR扩增仪。
SN/T4853.3—2017
数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器。
恒温孵育箱：控温精度士1.0℃。样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末。核酸定量仪：Nanodrop30oo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。涡旋振荡仪。
离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。移液枪：量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求。7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2
数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TagDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂。
7.3引物和探针：SPS基因和科丰6号转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。7.4
数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。96孔荧光定量PCR反应板和封膜。0.2mL和1.5mL离心管。
移液枪头，量程0.5μL10μL；量程10μL～100μL；量程100μL~1000μL。表1SPS基因和科丰6号转化体特异性序列的引物和探针扩增基因
SPS基因
科丰6号转化
体特异性序列
上游引物
下游引物
上游引物
下游引物
序列（5'-3'）
GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG
GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC
VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1GTGGTATCCTACCTCTCCCAGC
CGCAGCATGGTTCTCAGTACA
FAM-TACCGCCGTGTGCCCGTGTC-BHQ1注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。PCR扩增片段长度
注2：荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式标记。
注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至10μmol/L后分装，-20℃避光保存3bZxz.net
SN/T4853.3—2017
8实验步骤
8.1抽样
按照GB/T19495.7的规定执行。
8.2样品制备
除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放入样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。8.3核酸提取纯化
8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行。称取2份（每份2g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。8.3.2模板浓度控制
采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书为保证定量结果的准确性，体系中总模数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷板数应不低于400个拷贝。将样品DNA贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测，数字PCR扩增
8.4.1数字PCR体系配制
按表2将各组分加人洁净离心管中，充分混匀表2数字PCR反应体系
2×数字PCR预混液
SPS基因正向引物（10μmol/L)
SPS基因反向引物(10 μmol/L)
SPS基因荧光标记探针（10μmol/L)DNA模板
dH,O（无菌水）
2×数字PCR预混液
科丰6号正向引物（10μmol/L）4
内源基因反应体系
外源基因反应体系
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.12μmol/L
0.32μmol/L
科丰6号反向引物（10μmol/L）表2（续）
外源基因反应体系
科丰6号荧光标记探针溶液（10μmol/L）DNA模板
dH,O(无菌水）
终浓度
SN/T4853.3—2017
0.32μmol/L
0.2μmol/L
注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字PCR仪作相应调整。PCR体系配制及转移时尽量避免产生气泡。
8.4.2微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字PCR反应混合液，加人微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃，5min（1℃/s）1个循环：94℃.15s60C.lmin(1
s），50个循环；98℃10min（1℃/s），1个循环；12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测，记录阳性和阴性微反应体系数量及其比值。根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数（拷贝/μL）和科丰6号转化体特异性序列拷贝数
（拷贝/μL）。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整9
检测质量控制
9.1对照设置
阴性对照（NC)、空白对照（NTC)和阳性对照(PC)的设置如NC：采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；a）
NTC：采用水作为数字PCR反应模板b）
c）PC：采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板
每个测试样和PC的SPS基因或科丰6号转化体特异性序列的数字PCR需设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%9.2
检测结果有效性判定
以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：NC和NTC的科丰6号转化体特异性检测无阳性扩增；a)
PC的SPS基因或科丰6号转化体特异性序列检测有阳性扩增；b）
PC的定量结果与已知值相符。
10结果计算
10.1数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和科丰6号转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照式（1)计算测试样的转基因成分含量：C×D×100%
·（1)
SN/T4853.3—2017
式中：
A转基因大米品系科丰6号的含量，%；B——KF6转化体特异性序列拷贝数；C水稻内标准基因SPS拷贝数；
D—转换系数。
注：不同的大米或水稻样品有不同的转换系数，具体为：市售杂交稻种样品（F1代）的转换系数为0.33，市售杂交稻谷和大米样品（F2代）的转换系数为0.50。10.2
如两个测试样的科丰6号品系含量的相对相差大于或等于35%，则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3
如两个测试样的科丰6号品系含量的相对相差小于35%，则样品的定量检测结果等于两个测试样转基因大米品系科丰6号成分含量的平均值。11
结果表述
定量检测结果有四种情况，每种检测结果的表述如表3所示。表3
结果表述
检测结果
未检出SPS基因
检出SPS基因，但未检出科丰6号转化体特异性序列检出SPS基因和科丰6号转化体特异性序列，但其含量小于定量方法检测低限
检出SPS基因和科丰6号转化体特异性序列，其含量大于定量方法检测低限
未检出大米成分
结果表述
未检出转基因大米科丰6号品系成分检出转基因大米科丰6号品系成分，但含量低于本定量方法的LOQ（0.1%）
检出转基因大米科丰6号品系成分，含量为X%附录A
（资料性附）
转基因大米科丰6号转化体特异性序列SN/T4853.3—2017
转基因大米科丰6号转化体特异性序列TGGTATCCTACCTCTCCCAGCGGCTACGTAGTACGTACCGCCGTGTGCCCGTGTCCCCGCGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCGA注：阴影部分为转基因大米品系科丰6号外源基因序列，带下划线部分为水稻基因组序列。
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转基因大米定量检测
数字PCR法
第3部分：科丰6号品系
Quantitative detection of genetically modified riceDigital PCR-Part3:EventKF6
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4853《转基因大米定量检测第1部分：TT51-1品系；
第2部分：克稻品系；
第3部分：科丰6号品系；
—第4部分：M12品系；
第5部分：LL62品系；
—第6部分：T2A-1品系；
-第7部分：T1C-19品系。
数字PCR法》系列标准共分为7部分：本部分为SN/T4853标准的第3部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4853.3-—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：黄文胜、陈颖、邓婷婷、吴亚君、付伟、聂丹丹、朱水芳、韩建勋、李想。I
1范围
数字PCR法
转基因大米定量检测
第3部分：科丰6号品系
本部分规定了稻谷和大米中科丰6号品系的数字PCR定量检测方法。本部分适用于稻谷和大米中科丰6号品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。2规范性引用文件
SN/T4853.3—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.1
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3
转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5
GB/T19495.7
转基因产品检测
转基因产品检测
核酸定量PCR检测方法
抽样和制样方法
SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
SPS基因Thegene of sucrosephosphate synthase蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。3.1.2
event-specificsequenceofKF6
科丰6号转化体特异性序列
外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。3.1.3
Taq酶TaqDNApolymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。3.1.4
template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。SN/T4853.3—2017
定量检测低限limitofquantification；LoQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。3.1.6
qualitycontrol sample
质控样品
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA。3.1.7
微反应体系
tinyreactionsystem
将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。3.1.8
文Conversionfactor
转换系数
将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（质量分数)时所用系数。3.1.9
fFluorescentlytaggedprobe
荧光标记探针
在5'末端和3'末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5'-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）bp：碱基对（basepair）
NC：阴性对照（negaitivecontrol）NTC：空白对照（notemplatecontrol）PC：阳性对照（positivecontrol）4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecificsequence）和内参照基因（speciesspecificgene)的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。2
仪器和设备
超纯水发生器（分子生物学级别）。分析天平：感量0.1g和0.1mg。
6.3生物安全柜。
PCR扩增仪。
SN/T4853.3—2017
数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器。
恒温孵育箱：控温精度士1.0℃。样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末。核酸定量仪：Nanodrop30oo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。涡旋振荡仪。
离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。移液枪：量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求。7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2
数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TagDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂。
7.3引物和探针：SPS基因和科丰6号转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。7.4
数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。96孔荧光定量PCR反应板和封膜。0.2mL和1.5mL离心管。
移液枪头，量程0.5μL10μL；量程10μL～100μL；量程100μL~1000μL。表1SPS基因和科丰6号转化体特异性序列的引物和探针扩增基因
SPS基因
科丰6号转化
体特异性序列
上游引物
下游引物
上游引物
下游引物
序列（5'-3'）
GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG
GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC
VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1GTGGTATCCTACCTCTCCCAGC
CGCAGCATGGTTCTCAGTACA
FAM-TACCGCCGTGTGCCCGTGTC-BHQ1注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。PCR扩增片段长度
注2：荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式标记。
注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至10μmol/L后分装，-20℃避光保存3bZxz.net
SN/T4853.3—2017
8实验步骤
8.1抽样
按照GB/T19495.7的规定执行。
8.2样品制备
除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放入样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。8.3核酸提取纯化
8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行。称取2份（每份2g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。8.3.2模板浓度控制
采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书为保证定量结果的准确性，体系中总模数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷板数应不低于400个拷贝。将样品DNA贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测，数字PCR扩增
8.4.1数字PCR体系配制
按表2将各组分加人洁净离心管中，充分混匀表2数字PCR反应体系
2×数字PCR预混液
SPS基因正向引物（10μmol/L)
SPS基因反向引物(10 μmol/L)
SPS基因荧光标记探针（10μmol/L)DNA模板
dH,O（无菌水）
2×数字PCR预混液
科丰6号正向引物（10μmol/L）4
内源基因反应体系
外源基因反应体系
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.12μmol/L
0.32μmol/L
科丰6号反向引物（10μmol/L）表2（续）
外源基因反应体系
科丰6号荧光标记探针溶液（10μmol/L）DNA模板
dH,O(无菌水）
终浓度
SN/T4853.3—2017
0.32μmol/L
0.2μmol/L
注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字PCR仪作相应调整。PCR体系配制及转移时尽量避免产生气泡。
8.4.2微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字PCR反应混合液，加人微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃，5min（1℃/s）1个循环：94℃.15s60C.lmin(1
s），50个循环；98℃10min（1℃/s），1个循环；12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测，记录阳性和阴性微反应体系数量及其比值。根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数（拷贝/μL）和科丰6号转化体特异性序列拷贝数
（拷贝/μL）。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整9
检测质量控制
9.1对照设置
阴性对照（NC)、空白对照（NTC)和阳性对照(PC)的设置如NC：采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；a）
NTC：采用水作为数字PCR反应模板b）
c）PC：采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板
每个测试样和PC的SPS基因或科丰6号转化体特异性序列的数字PCR需设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%9.2
检测结果有效性判定
以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：NC和NTC的科丰6号转化体特异性检测无阳性扩增；a)
PC的SPS基因或科丰6号转化体特异性序列检测有阳性扩增；b）
PC的定量结果与已知值相符。
10结果计算
10.1数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和科丰6号转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照式（1)计算测试样的转基因成分含量：C×D×100%
·（1)
SN/T4853.3—2017
式中：
A转基因大米品系科丰6号的含量，%；B——KF6转化体特异性序列拷贝数；C水稻内标准基因SPS拷贝数；
D—转换系数。
注：不同的大米或水稻样品有不同的转换系数，具体为：市售杂交稻种样品（F1代）的转换系数为0.33，市售杂交稻谷和大米样品（F2代）的转换系数为0.50。10.2
如两个测试样的科丰6号品系含量的相对相差大于或等于35%，则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3
如两个测试样的科丰6号品系含量的相对相差小于35%，则样品的定量检测结果等于两个测试样转基因大米品系科丰6号成分含量的平均值。11
结果表述
定量检测结果有四种情况，每种检测结果的表述如表3所示。表3
结果表述
检测结果
未检出SPS基因
检出SPS基因，但未检出科丰6号转化体特异性序列检出SPS基因和科丰6号转化体特异性序列，但其含量小于定量方法检测低限
检出SPS基因和科丰6号转化体特异性序列，其含量大于定量方法检测低限
未检出大米成分
结果表述
未检出转基因大米科丰6号品系成分检出转基因大米科丰6号品系成分，但含量低于本定量方法的LOQ（0.1%）
检出转基因大米科丰6号品系成分，含量为X%附录A
（资料性附）
转基因大米科丰6号转化体特异性序列SN/T4853.3—2017
转基因大米科丰6号转化体特异性序列TGGTATCCTACCTCTCCCAGCGGCTACGTAGTACGTACCGCCGTGTGCCCGTGTCCCCGCGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCGA注：阴影部分为转基因大米品系科丰6号外源基因序列，带下划线部分为水稻基因组序列。
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