中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4848.3—2017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第3部分：洋槐 (Identification of common honey plant species in export honey—Real-time PCR method, Part 3: Locust tree) 2017-07-21发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2018-03-01实施 前言 SN/T 4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法》共分为8部分：第1部分：荆条；第2部分：油菜；第3部分：洋槐；第4部分：楼树；第5部分：机树；第6部分：龙眼；第7部分：荔枝和龙眼；第8部分：紫云英。本部分为SN/T 4848的第3部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。本部分主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、黄文胜、韩建勋、张九凯、刘鸣畅、邓婷婷、宗凯。 1 范围 SN/T 4848的本部分规定了出口蜂蜜中洋槐成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于出口蜂蜜中洋槐成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%（质量百分比）。 2 规范性引用文件 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文。 3.1 蜂蜜 honey：蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。 3.2 洋槐 locust tree：洋槐（Robinia pseudoacacia），又名刺槐，豆科、蝶形花亚科刺槐属植物。 3.3 实时荧光PCR real-time PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。 3.4 Ct值 cycle threshold：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷 [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid） Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus） OD：光度密度（optical density） FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine） BHQ1：黑洞猝灭基团1（Black hole quencher 1） 5 方法提要 提取样品DNA，以洋槐来源DNA为阳性对照，以其它蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在洋槐成分。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 检测用引物和探针：洋槐成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表6.1-1。