SN/T 4076-2014
基本信息
标准号： SN/T 4076-2014
中文名称：百合无症病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4076-2014.Detection and identification of lily symptomless virus.
1范围
SN/T 4076规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。
SN/T 4076适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2119进境 观赏鳞球茎检疫操作规程
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3百合无症病毒
英文名称:lily symptomless virus
缩写:LSV
同种异名:lily streak virus、lily symptomless carlavirus 、lily curl stripe virus、Alstroemeria carla-virus.、Alstroemeria latent virus、lily virus。
分类地位:芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)、β线状病毒科(Betaflexiviridae)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径:经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。
LSV的其他信息参见附录A。
4方法原理
百合无症病毒(LSV)的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
5主要仪器设备及用具
植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g).PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成
像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200 μL、100μL、20μL、10μL、2uL)。
1范围
SN/T 4076规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。
SN/T 4076适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2119进境 观赏鳞球茎检疫操作规程
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3百合无症病毒
英文名称:lily symptomless virus
缩写:LSV
同种异名:lily streak virus、lily symptomless carlavirus 、lily curl stripe virus、Alstroemeria carla-virus.、Alstroemeria latent virus、lily virus。
分类地位:芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)、β线状病毒科(Betaflexiviridae)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径:经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。
LSV的其他信息参见附录A。
4方法原理
百合无症病毒(LSV)的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
5主要仪器设备及用具
植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g).PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成
像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200 μL、100μL、20μL、10μL、2uL)。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4076—2014
百合无症病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of lily symptomless virus2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4076—2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、方志鹏、林石明、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英1范围
百合无症病毒检疫鉴定方法
本标准规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。SN/T4076-2014
本标准适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2119进境观赏鳞球茎检疫操作规程进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2122
3百合无症病毒
英文名称：lilysymptomlessvirus缩写：LSV
同种异名:lily streak virus，lily symptomless carlavirus，lily curl stripe virus、Alstroemeria carlavirus,Alstroemeria latent virus,lily virus。分类地位：芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales）、β线状病毒科（Betaflexiviridae）、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径：经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。LSV的其他信息参见附录A。
方法原理
百合无症病毒(LSV)的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。主要仪器设备及用具
植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100 μL、20 μL,10 μL、2 μL)。主要试剂
血清学试剂见附录B、分子生物学试剂见附录C和附录D。SN/T4076—2014
7检测与鉴定
抽样检查
按照SN/T2119、SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。7.2血清学检测(DAS-ELISA方法）按附录B给出的方法进行检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。
分子生物学检测
7.3.1RT-PCR检测
按附录C给出的方法，提取样品总RNA，进行RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.2实时荧光RT-PCR检测
按附录D给出的方法，提取样品总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.3序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列与已知的LSV相应序列进行比对，如果与已知的LSV相应序列具有高度同源性，则判定为LSV序列，否则为非LSV序列。注1：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/注2：国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）关于香石竹潜隐病毒属（Car-lauirus)种类区分标准之一：外壳蛋白或聚合酶基因核苷酸序列同源性低于72%(或氨基酸低于80%)。8结果判定
采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV)。8.1
8.2采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阳性时，用分子生物学方法进行验证：-当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒(LSV)
-当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阳性时，则判定检出百合无症病毒（LSV)。8.3采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定分析：当测定的序列为LSV序列时，则判定检出百合无症病毒(LSV)；一当测定的序列非LSV序列时，则判定未检出百合无症病毒(LSV)。8.4·采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV)。9结果记录与样品保存
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，PCR检测结果保存电泳照片。检出LSV的叶片，鳞球茎等样品，在超低温冰箱中保存，或冻干后低温保存，至少1年，以备复核。2
附录A
（资料性附录）
百合无症病毒基本信息
目前，已报道LSV的主要国家或地区有：欧洲：保加利亚、意大利、荷兰、波兰、英国；一亚洲：中国(台湾、云南）、印度、日本、韩国；—北美洲：美国(俄勒冈州)；
一大洋洲：新西兰。
寄主范围
自然寄主
SN/T 4076—2014
LSV主要侵染百合科（Liliaceae）的百合属（Lilium）、印加百合属（Alstroemeria）和郁金香属（Tu-lipa)植物。
另外，LSV还可以侵染石蒜科（Amaryllidaceae）水鬼蕉属（Hymenocallis）的水鬼燕（H.littora-lis)。
诊断寄主
香百合（Liliumlongiflorum）在苗期与黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus）一起侵染可以产生坏死雀斑。特征性的雀斑在接种后的3周产生。该症状与叶脉平行，开始时褪绿，而后变成灰褥色、坏死。
单独接种百合无症病毒（LSV)的麝香百合（L.longiflorum），在低于15.5℃温度下生长，大约在接种60d～90d后产生卷曲条纹（曲型的白色条纹，叶片急速卷曲）。A.3
形态特征
病毒粒体（见图A.1)通常为弯曲的线状，长度640nm，宽17nm～18nm，具有明显的轴槽。3
SN/T4076—2014
图A.1LSV的病毒粒体（Wangetal.,2007;Derksetal.,2002)标尺均为200nmA.4基因组特征
基因组为正义、单链的RNA分子，全长约8394bp[不含poly（A)尾]，具有6个开放阅读框(ORF)，从5到3’末端分别编码Mr220kDa（1，948aa）、25kDa（228aa）、12kDa（106aa）、7kDa(64aa）、32kDa(291aa)和16kDa(140aa)蛋白（参见图A.2)。ORF5(7140-8015nts)编码291aa的外壳蛋白(CP)，基因组RNA被单一的CP包裹2
Replicase(220 K)
J25kzkcP(32k)
图A.2LSV基因组结构示意图（Choi&Ryu，2003）A.5症状特征
百合无症病毒(LSV)单独侵染时一般无明显症状，但在一定温度下有的品种能显症，如叶片呈现扭曲或出现白色条纹。引起的症状严重时，可导致叶片产生坏死，甚至造成叶片凋萎。该病毒在自然界与其他病毒复合侵染，如与黄瓜花叶病毒复合侵染，引起坏死斑；与郁金香碎色病毒复合侵染，叶片出现条纹斑驳或鳞茎上出现褐斑。
ELISA所采用的试剂及配制方法
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠(NazCO,）
碳酸氢钠（NaHCO，）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
(规范性附录）
DAS-ELISA检测方法
加人900mL水溶解，用盐酸调节pH值到9.6，然后加水至1L。SN/T4076—2014
注：叠氮化钠(NaN，)为高毒类化学药品，使用时必须采取必要的防护措施。若没有配备必要的防护措施，可不添加。
磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4）
氯化钠(NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
氯化钾（KCI)）
叠氮化钠(NaN.）
加人900mL水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH值到7.4，然后加水至1L。B.1.3
每升PBS中加人0.5mL的吐温一20。B.1.4
样品提取缓冲液（pH7.4）Www.bzxZ.net
向1000mL的PBST中加人20.0g的聚乙烯基吡略咯烷酮(PVP，MW10000～40000)。B.1.5
酶标抗体稀释缓冲液
向1000mL的PBST中加人：
牛血清白蛋白(BSA)
聚乙烯基吡略烷酮（PVP，MW24～40000）调节pH值到7.4，保存在4℃冰箱中。B.1.6
底物缓冲液
二乙醇胺
叠氮化钠（NaNs）
用盐酸调整pH至9.8，然后加水到1L。保存在4℃C冰箱中。注：缓冲液可以储存在4℃～10℃中至少2个月，使用前回温至室温。5
SN/T4076—2014
B.1.7抗体
LSV多克隆(或单克隆)抗体、碱性磷酸酯酶标记的LSV多克隆(或单克隆)抗体B.2
操作步骤
检测样品的制备
按1：5的比例（质量：体积)在检测样品中加人样品提取缓冲液，用研钵或植物汁液提取仪研磨成匀浆后，离心，上清液进行DAS-ELISA检测。示例：
每个种球取约0.1g的鳞片，6个种球样品混合成一个检测样品（约0.6g).加人3mL的样品提取缓冲液用研钵或植物汁液提取仪（如；MEKUErichPollahneGmbH)\研磨，转移到5mL离心管中，8000r/min离心10min，上清液进行DAS-ELISA检测。
包被抗体
根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释LSV抗体。在96孔微孔板中每孔加入100μL包被抗体溶液。在室温或37℃下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。加入检测样品
倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗3～4次孔（可在洗板机上完成）。加入100μL按照B.2.1方法制备的检测样品提取液到酶标板的相应孔中，每个样品至少2个孔。并设置阳性、空白和阴性对照。B.2.3.3
在室温或37℃下孵育2h或4℃下过夜。加入酶标抗体
在孵育完成前，根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释LSV酶标抗体（如1：200）。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100μL酶标抗体溶液。在室温或37℃下孵育2h。
加入底物
用底物缓冲液配制1mg/mL的底物溶液。注：在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，以避免在阴性对照孔中出现背景颤色。B.2.5.2
倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液。吸光值测定
室温下避光放置（约30min～60min），至阳性对照孔明显显色。用酶标仪在405nm处读取吸光值。
ErichPollahneGmbH是由MEKU提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认1)
可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品6
结果判定
SN/T4076—2014
对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：B.3.1
——缓冲液孔和阴性对照孔的ODes值<0.15，当阴性对照孔的OD40s值<0.05时，按0.05计算；—阳性对照OD4os值/阴性对照ODes值>5～10；同一样品的重复性基本一致。
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果判定如下：样品OD4o5值/阴性对照OD40s值>2，判为阳性；一样品OD40s值/阴性对照ODaos值接近阔值，判为可疑样品，需重新做一次或用RT-PCR方法验证；
一样品OD4es值/阴性对照OD40s值<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。7
SN/T40762014
主要试剂
RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
TRlzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddHO。C.1.2
RT-PCR试剂
5XRT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）、M-MuLV反转录酶（200U/μL）、RNA酶抑制剂(RNasin）、10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg+）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）。c.1.3
10×TBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)Tris碱
NaEDTA
加水溶解，定容到1L。
电泳试剂
琼脂糖、0.5ug/μL的溴化乙锭溶液、10XTBE缓冲液。C.1.5
引物序列与合成
目前，已报道多对用于检测LSV的RT-PCR引物（Takamatsuetal.，1994；Derksetal.，2002；Niimietal.，2003；徐榕雪等，2007；王继华等，2005；郑耘等，2010）。本标准采用Derks等（2002)设计的1对引物及重新设计的1对引物，其引物及序列均见表C.1。其中，LSV-CP-f2/LSV-CP-r2扩增的片断较小，具有更好的灵敏度；LSV-CP-f3/LSV-CP-r3所扩增片段包含完整的CP基因，可获得完整的CP基因序列。
引物名称
LSV-CP-f2
引物序列（5\-3\）
GAACCCTGCGAACCCCTAC
引物序列及其位置
基因名称
LSV-CP-r2CAGACTTTCCGCAGTCCAGCLSV-CP-f3GCACATTTCCGAGCAATCTCACACLSV-CP-r3CGATAACACCTCTCACACCTGCCTGBp3
7385-7403
7687-7668
7044-7067
81868164
退火温度
参考文献
Derks et al.,2002
CP：外壳蛋白基因(Coatproteingene)；TGBp3；三基因块蛋白3(triplegeneblockprotein3)；ORF6：核酸结合蛋白（Nucleic acid binding protein)。为GenBank上叠录号为AJ516059的基因序列相对位置c.2
总RNA的提取
采用TRIzolReagent方法提取病叶总RNA，具体操作如下：SN/T 4076-—2014
取0.05g～0.1g的病叶放人研钵中，加入1mL的TRIzolReagent充分研磨，15℃～30℃下静置5min。
注：也可以取250pL的B.2.1.1中制备的上清液，加人750μL的TRIzolReagent，混匀，15℃～30℃下静置5min。在2℃～8℃下12000g离心10min；把上清液转移到一新管中，并加人0.2mL三氯甲烷，盖好管盖，剧烈振荡15s，15℃～30℃放置3min。—4℃12000g离心15min，取上层无色水相（约600μL)转移到新管中。在得到的水相溶液中加人等体积异丙醇，混匀，15℃～30℃静置10min。-2℃~8℃下12000g离心10min。弃上清液，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。2℃～8℃下7500g离心3min，弃尽上清液。室温放置晾干，待乙醇挥发完毕，加人100μL无RNase水，充分溶解RNA，置于一20℃保存备用。
注：在能够保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。cDNA合成
利用反转录酶合成cDNA，即在3μL的总RNA中加人1μL的3'端引物（10μmol/L)或Oligod(T)15，于95℃的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5×反转录缓冲液2.5μL、10mmol/L的dNTP混合物0.5μL、M-MLV反转录酶0.5μL、核糖核酸酶抑制剂0.5μL、无RNase的双蒸水4.5μL。然后37℃水浴处理1h，95℃水浴10min，自然冷却至室温，即合成的cDNA，作为后续PCR的模板。
C.4PCR扩增
在25μL体系中加人2μL上述合成的cDNA模板，进行PCR扩增。即2.5μL的10×PCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+），dNTP0.5μL（每种各10mmol/L），TaqDNA聚合酶0.5μL（2.5U/μL），上游引物2μL(5μmol/L），下游引物2μL(5μmol/L），cDNA模板2μL，用超纯水补足至25μL。反应条件：95℃预变性3min，然后94℃变性30s、退火30s（见表C.1）、72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸7min。
琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取适量（如5μL)的RT-PCR产物与适量的（如1μL)的6×上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中，然后在一定电压下（如120V)电泳。电泳结束后，放人装有0.5μg/μL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。结果判定
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生预期大小条带情况下：如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阴性。9
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百合无症病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of lily symptomless virus2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4076—2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、方志鹏、林石明、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英1范围
百合无症病毒检疫鉴定方法
本标准规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。SN/T4076-2014
本标准适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2119进境观赏鳞球茎检疫操作规程进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2122
3百合无症病毒
英文名称：lilysymptomlessvirus缩写：LSV
同种异名:lily streak virus，lily symptomless carlavirus，lily curl stripe virus、Alstroemeria carlavirus,Alstroemeria latent virus,lily virus。分类地位：芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales）、β线状病毒科（Betaflexiviridae）、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径：经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。LSV的其他信息参见附录A。
方法原理
百合无症病毒(LSV)的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。主要仪器设备及用具
植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100 μL、20 μL,10 μL、2 μL)。主要试剂
血清学试剂见附录B、分子生物学试剂见附录C和附录D。SN/T4076—2014
7检测与鉴定
抽样检查
按照SN/T2119、SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。7.2血清学检测(DAS-ELISA方法）按附录B给出的方法进行检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。
分子生物学检测
7.3.1RT-PCR检测
按附录C给出的方法，提取样品总RNA，进行RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.2实时荧光RT-PCR检测
按附录D给出的方法，提取样品总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。7.3.3序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列与已知的LSV相应序列进行比对，如果与已知的LSV相应序列具有高度同源性，则判定为LSV序列，否则为非LSV序列。注1：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/注2：国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）关于香石竹潜隐病毒属（Car-lauirus)种类区分标准之一：外壳蛋白或聚合酶基因核苷酸序列同源性低于72%(或氨基酸低于80%)。8结果判定
采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV)。8.1
8.2采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阳性时，用分子生物学方法进行验证：-当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒(LSV)
-当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阳性时，则判定检出百合无症病毒（LSV)。8.3采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定分析：当测定的序列为LSV序列时，则判定检出百合无症病毒(LSV)；一当测定的序列非LSV序列时，则判定未检出百合无症病毒(LSV)。8.4·采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV)。9结果记录与样品保存
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，PCR检测结果保存电泳照片。检出LSV的叶片，鳞球茎等样品，在超低温冰箱中保存，或冻干后低温保存，至少1年，以备复核。2
附录A
（资料性附录）
百合无症病毒基本信息
目前，已报道LSV的主要国家或地区有：欧洲：保加利亚、意大利、荷兰、波兰、英国；一亚洲：中国(台湾、云南）、印度、日本、韩国；—北美洲：美国(俄勒冈州)；
一大洋洲：新西兰。
寄主范围
自然寄主
SN/T 4076—2014
LSV主要侵染百合科（Liliaceae）的百合属（Lilium）、印加百合属（Alstroemeria）和郁金香属（Tu-lipa)植物。
另外，LSV还可以侵染石蒜科（Amaryllidaceae）水鬼蕉属（Hymenocallis）的水鬼燕（H.littora-lis)。
诊断寄主
香百合（Liliumlongiflorum）在苗期与黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus）一起侵染可以产生坏死雀斑。特征性的雀斑在接种后的3周产生。该症状与叶脉平行，开始时褪绿，而后变成灰褥色、坏死。
单独接种百合无症病毒（LSV)的麝香百合（L.longiflorum），在低于15.5℃温度下生长，大约在接种60d～90d后产生卷曲条纹（曲型的白色条纹，叶片急速卷曲）。A.3
形态特征
病毒粒体（见图A.1)通常为弯曲的线状，长度640nm，宽17nm～18nm，具有明显的轴槽。3
SN/T4076—2014
图A.1LSV的病毒粒体（Wangetal.,2007;Derksetal.,2002)标尺均为200nmA.4基因组特征
基因组为正义、单链的RNA分子，全长约8394bp[不含poly（A)尾]，具有6个开放阅读框(ORF)，从5到3’末端分别编码Mr220kDa（1，948aa）、25kDa（228aa）、12kDa（106aa）、7kDa(64aa）、32kDa(291aa)和16kDa(140aa)蛋白（参见图A.2)。ORF5(7140-8015nts)编码291aa的外壳蛋白(CP)，基因组RNA被单一的CP包裹2
Replicase(220 K)
J25kzkcP(32k)
图A.2LSV基因组结构示意图（Choi&Ryu，2003）A.5症状特征
百合无症病毒(LSV)单独侵染时一般无明显症状，但在一定温度下有的品种能显症，如叶片呈现扭曲或出现白色条纹。引起的症状严重时，可导致叶片产生坏死，甚至造成叶片凋萎。该病毒在自然界与其他病毒复合侵染，如与黄瓜花叶病毒复合侵染，引起坏死斑；与郁金香碎色病毒复合侵染，叶片出现条纹斑驳或鳞茎上出现褐斑。
ELISA所采用的试剂及配制方法
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠(NazCO,）
碳酸氢钠（NaHCO，）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
(规范性附录）
DAS-ELISA检测方法
加人900mL水溶解，用盐酸调节pH值到9.6，然后加水至1L。SN/T4076—2014
注：叠氮化钠(NaN，)为高毒类化学药品，使用时必须采取必要的防护措施。若没有配备必要的防护措施，可不添加。
磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4）
氯化钠(NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
氯化钾（KCI)）
叠氮化钠(NaN.）
加人900mL水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH值到7.4，然后加水至1L。B.1.3
每升PBS中加人0.5mL的吐温一20。B.1.4
样品提取缓冲液（pH7.4）Www.bzxZ.net
向1000mL的PBST中加人20.0g的聚乙烯基吡略咯烷酮(PVP，MW10000～40000)。B.1.5
酶标抗体稀释缓冲液
向1000mL的PBST中加人：
牛血清白蛋白(BSA)
聚乙烯基吡略烷酮（PVP，MW24～40000）调节pH值到7.4，保存在4℃冰箱中。B.1.6
底物缓冲液
二乙醇胺
叠氮化钠（NaNs）
用盐酸调整pH至9.8，然后加水到1L。保存在4℃C冰箱中。注：缓冲液可以储存在4℃～10℃中至少2个月，使用前回温至室温。5
SN/T4076—2014
B.1.7抗体
LSV多克隆(或单克隆)抗体、碱性磷酸酯酶标记的LSV多克隆(或单克隆)抗体B.2
操作步骤
检测样品的制备
按1：5的比例（质量：体积)在检测样品中加人样品提取缓冲液，用研钵或植物汁液提取仪研磨成匀浆后，离心，上清液进行DAS-ELISA检测。示例：
每个种球取约0.1g的鳞片，6个种球样品混合成一个检测样品（约0.6g).加人3mL的样品提取缓冲液用研钵或植物汁液提取仪（如；MEKUErichPollahneGmbH)\研磨，转移到5mL离心管中，8000r/min离心10min，上清液进行DAS-ELISA检测。
包被抗体
根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释LSV抗体。在96孔微孔板中每孔加入100μL包被抗体溶液。在室温或37℃下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。加入检测样品
倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗3～4次孔（可在洗板机上完成）。加入100μL按照B.2.1方法制备的检测样品提取液到酶标板的相应孔中，每个样品至少2个孔。并设置阳性、空白和阴性对照。B.2.3.3
在室温或37℃下孵育2h或4℃下过夜。加入酶标抗体
在孵育完成前，根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释LSV酶标抗体（如1：200）。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100μL酶标抗体溶液。在室温或37℃下孵育2h。
加入底物
用底物缓冲液配制1mg/mL的底物溶液。注：在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，以避免在阴性对照孔中出现背景颤色。B.2.5.2
倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液。吸光值测定
室温下避光放置（约30min～60min），至阳性对照孔明显显色。用酶标仪在405nm处读取吸光值。
ErichPollahneGmbH是由MEKU提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认1)
可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品6
结果判定
SN/T4076—2014
对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：B.3.1
——缓冲液孔和阴性对照孔的ODes值<0.15，当阴性对照孔的OD40s值<0.05时，按0.05计算；—阳性对照OD4os值/阴性对照ODes值>5～10；同一样品的重复性基本一致。
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果判定如下：样品OD4o5值/阴性对照OD40s值>2，判为阳性；一样品OD40s值/阴性对照ODaos值接近阔值，判为可疑样品，需重新做一次或用RT-PCR方法验证；
一样品OD4es值/阴性对照OD40s值<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。7
SN/T40762014
主要试剂
RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
TRlzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddHO。C.1.2
RT-PCR试剂
5XRT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）、M-MuLV反转录酶（200U/μL）、RNA酶抑制剂(RNasin）、10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg+）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）。c.1.3
10×TBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)Tris碱
NaEDTA
加水溶解，定容到1L。
电泳试剂
琼脂糖、0.5ug/μL的溴化乙锭溶液、10XTBE缓冲液。C.1.5
引物序列与合成
目前，已报道多对用于检测LSV的RT-PCR引物（Takamatsuetal.，1994；Derksetal.，2002；Niimietal.，2003；徐榕雪等，2007；王继华等，2005；郑耘等，2010）。本标准采用Derks等（2002)设计的1对引物及重新设计的1对引物，其引物及序列均见表C.1。其中，LSV-CP-f2/LSV-CP-r2扩增的片断较小，具有更好的灵敏度；LSV-CP-f3/LSV-CP-r3所扩增片段包含完整的CP基因，可获得完整的CP基因序列。
引物名称
LSV-CP-f2
引物序列（5\-3\）
GAACCCTGCGAACCCCTAC
引物序列及其位置
基因名称
LSV-CP-r2CAGACTTTCCGCAGTCCAGCLSV-CP-f3GCACATTTCCGAGCAATCTCACACLSV-CP-r3CGATAACACCTCTCACACCTGCCTGBp3
7385-7403
7687-7668
7044-7067
81868164
退火温度
参考文献
Derks et al.,2002
CP：外壳蛋白基因(Coatproteingene)；TGBp3；三基因块蛋白3(triplegeneblockprotein3)；ORF6：核酸结合蛋白（Nucleic acid binding protein)。为GenBank上叠录号为AJ516059的基因序列相对位置c.2
总RNA的提取
采用TRIzolReagent方法提取病叶总RNA，具体操作如下：SN/T 4076-—2014
取0.05g～0.1g的病叶放人研钵中，加入1mL的TRIzolReagent充分研磨，15℃～30℃下静置5min。
注：也可以取250pL的B.2.1.1中制备的上清液，加人750μL的TRIzolReagent，混匀，15℃～30℃下静置5min。在2℃～8℃下12000g离心10min；把上清液转移到一新管中，并加人0.2mL三氯甲烷，盖好管盖，剧烈振荡15s，15℃～30℃放置3min。—4℃12000g离心15min，取上层无色水相（约600μL)转移到新管中。在得到的水相溶液中加人等体积异丙醇，混匀，15℃～30℃静置10min。-2℃~8℃下12000g离心10min。弃上清液，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。2℃～8℃下7500g离心3min，弃尽上清液。室温放置晾干，待乙醇挥发完毕，加人100μL无RNase水，充分溶解RNA，置于一20℃保存备用。
注：在能够保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。cDNA合成
利用反转录酶合成cDNA，即在3μL的总RNA中加人1μL的3'端引物（10μmol/L)或Oligod(T)15，于95℃的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5×反转录缓冲液2.5μL、10mmol/L的dNTP混合物0.5μL、M-MLV反转录酶0.5μL、核糖核酸酶抑制剂0.5μL、无RNase的双蒸水4.5μL。然后37℃水浴处理1h，95℃水浴10min，自然冷却至室温，即合成的cDNA，作为后续PCR的模板。
C.4PCR扩增
在25μL体系中加人2μL上述合成的cDNA模板，进行PCR扩增。即2.5μL的10×PCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+），dNTP0.5μL（每种各10mmol/L），TaqDNA聚合酶0.5μL（2.5U/μL），上游引物2μL(5μmol/L），下游引物2μL(5μmol/L），cDNA模板2μL，用超纯水补足至25μL。反应条件：95℃预变性3min，然后94℃变性30s、退火30s（见表C.1）、72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸7min。
琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取适量（如5μL)的RT-PCR产物与适量的（如1μL)的6×上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中，然后在一定电压下（如120V)电泳。电泳结束后，放人装有0.5μg/μL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。结果判定
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生预期大小条带情况下：如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阴性。9
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