SN/T 3949-2014.Plastic package-Determination of harmful material bisphenol A-Conjuction of antigen and antibody method.
1范围
SN/T 3949规定了塑料包装双酚A的抗原抗体结合测定方法的试剂和材料、仪器、试验步骤和结果计算。
SN/T 3949适用于塑料包装双酚A的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3方法原理
塑料经过超声提取后获得的滤液用于后续的检测。在酶标板上固定一-定量的双酚A偶联抗原,加人样本溶液或双酚A标准品溶液后,接着加人一定量的双酚A特异性抗体,使待测抗原和固定抗原竞争性地与溶液中游离的双酚A特异性抗体结合,充分洗涤未反应的抗体和抗原，再加人一定量的酶标二抗(抗抗体)进行放大作用,充分洗涤后,加底物显色液显色。结果如待测抗原含量越多,与固相抗体结合的抗体越少,酶标二抗的量就越少,显色越浅,两者垦负相关。此实验的条件是:固定抗原限量,抗体定量,酶标二抗限量。固定抗原与待测抗原和抗体结合的位点相同,竞争性地与抗体结合。
4试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682中- - 级水的规格。
4.1 双酚A标准品(色谱纯,99%以上)。
4.2甲醇。
4.3牛血清蛋白。
4.4碳酸氢钠。
4.5碳酸钠。
4.6吐温20。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 39492014
塑料包装
有害物质双酚A的检测方法
抗原抗体结合法
Plastic package-Determination of harmful material bisphenol A-Conjuction of antigen and antibody method2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照 GB/T 1.1--2009 给出的规则起草本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并归口，SN/T3949-2014
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、海近岸科技有限公司。本标准主要起草人：缪文彬、周辉、陈柑、冉晓园、陶海华、张晓蓉、蔡丽君、朱洪坤，蒋伟、李蔚、郑华、蔡晓峰、朱化星。
1范園
塑料包装
有害物质双酚A的检测方法
抗原抗体结合法
SN/T 3949—2014
本标推规定了塑料包装双酚A的抗原抗体结合测定方法的试剂和材料，仪器，试验步骤和结果计算。
本标准适用于塑料包装双酚 A的测定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
塑料经过超声提取后获得的滤液用于后续的检测。在酶标板上固定一定量的双酚A偶联抗原，加入样本溶液或双酚A标谁品溶液后，接着加入一定量的妆酸A特异性抗体，使待测抗原和固定抗原竞争性地与溶窥中游离的酚A特异性抗体结合，充分洗涤未反应的抗体和抗原，再加人一定量的酶标二抗（抗抗体）进行放大作用，充分洗涤后，加底物显色显色，结果待测抗原含量越多，与固相抗体结合的抗体越少，酶标一抗的量就越少，显色越浅·两者呈负相关。此实验的条件是：周定抗原限量，抗体定量，酶标二抗限量。固定抗原与待测抗原利抗体结合的位点相同，竞争性地与抗体结合。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。4.1双酚A标准品（色谱纯，99%以上）。4.2 甲醇。
4.3牛血清蛋白。
4.4碳酸氢钠。
4.5碳酸钠。
4.6叶温20，
4.7磷酸氨二钠-1:二水合物：
4.8 磷酸二氢钾。
4.9氯化钾。
4.1D氯化钠。
4.11柠檬酸。
4.12醋酸钠。
4.13甘油。
SN/T3949—2014
乙二胺四乙酸二钠。
四甲基联苯胺。
二甲基亚砜。
甲苯。
硫酸。
30%双氧水。
双酚A标准水溶液（0.2ug/L,1.0μg/L,3.0μg/1，10.0μg/L,20.0μg/1.)：准确称取50.0mg双酚A粉末，用蒸馏水溶解，以蒸馏水定容至50mL。之后配成双酚A质量浓度分别为0.2uμg/L，1.0μg/1，3.0#g/L，10.0μg/L20.0μg/L的标准溶液。酶标二抗：HRP标记的羊抗兔IgG4.21
包被抗原双酚A-BSA（5.65mg/mL）双酚A多克隆抗体。
包被液（pH=9.6）：0.05mol/t碳酸盐缓冲液（CarbonateBuflersSaline，CBS），4℃保存。准确称取碳酸钠1.59g碳酸氢钠2.93g，溶于800L蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，加蒸馏水至1000mL
4.25PBS稀释液：磷酸盐缓冲液（PhoaphateBuffeSaline，PBS），4℃保存。准确称取氯化钠8g：氯化钾0.2g：磷酸二氢钾KH,PO.0g：磷酸氢钠十二水合物NaHPO,·12H.O2.9g.溶于800mL蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后加蒸谱水至1Q00mL4.26洗涤液：1000mLPBS稀释液加0.5mLTween-204.27封闭液：准确称取10.0mg
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红PBS森释液溶解，尽量不要起泡。底物显色液A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水0.3mL，溶于400ml蒸馏水中，待全部溶解后，加蒸馏水至500mL，4℃避光保存4.29底物显色液B：乙二胺四乙
2g，格檬酸0.95g甘油50mL0.15g四甲基联苯胺，3mL二甲基亚，溶于400mL蒸馏水中.待全部溶解后，加蒸馏水至500mL，4℃避光保存。5仪器
5.1酶标仪。
5.2天平0.1mg。
5.3氮吹仪。
5.4培养箱。
5.5洗板机。
5.6旋转蒸发仪。
6分析步骤
6.1样品预处理
将5g~10g塑料产品先人工剪碎成5mm×5mm以下大小，再粉碎成粉末状。称取0.5g（精确至0.01g）待测样品于25mL螺旋管中，加入20mL二氯甲烷，样品经超声萃取30min。将萃取液转移至250mL的平底烧瓶中，并用2ml甲醇分2次淋洗样品残渣，将淋洗液与萃取液合并，置丁旋转蒸发仪上浓缩至近干。用甲醇-水（1：9，体积比）溶解并定容至5ml，经0.22um有机相滤膜过滤，滤液用于后续检测。
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6.2抗原抗体结合检测
SN/T 3949—2014
将用包被液稀释2 000 倍的包被抗原双酚 A-BSA包被酶标板,每孔 100 μL,4 ℃过夜。取出酶标板.弃去包被液.甩干后置于洗板机中进行洗涤。程序设置为加洗涤液后静置1min，重复洗涤3次。洗后拍干。用封闭液进行封闭,每孔 120 μL,37℃作用1h后从培养箱中出，洗涤3次，拍下。将双酚A标准溶液0μg/L,0.2Pg/L,1.0g/L,3.0μ/1.,10.0/1,.20.0 Mg/L.依饮加入酶标板上的对应孔中,每孔 50μL;同时加人用 PBS配制好的稀释8 000 倍双酚 A多克隆抗体溶液,每孔 50 rL,放人37℃培养箱中温疗1 h 后洗涤 3 次,拍1。酶标二抗用 PB5稀释1 000倍,每孔加人 100 μL,37 ℃温育1 h,洗涤 4次,拍十。分别加人显色液 A 和显色液 B各 50 μL,室温暗处 5 min～10 min，向每孔中加50uL的2mal/L.的硫酸溶液。用嗨标仪测定其在150 nm的吸光度A。7 结果计算
7.1绘制标准曲线
每次实验均需重新绘制标准曲线。以双酚A标谁溶液吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值为横坐标绘制标推曲线。得出方程[见式(1)：A =a × lnc+b
式中：
吸光度，
斜率；
双酚A浓度(1g/L)的白然对数；
截距。
7,2 待测样品双酚 4 浓度的计算用式(2)计算待测样品滤液的双酚A浓度：C, =e[
式中：
待测样品滤液双酚 A浓度,单位为微克每升(μg/L);对数底为e；
吸光度；
斜率，
截距。
7.3样品双A浓度的计算
用式(3)计算待测样品滤液的双粉A浓度：C. =C,X 5 × 10 3/0. 5
武中：
待测样品效酚A含量，单位为微克每克（μg/g)；待测样品滤液双酚A浓度,单位为微克每升(μg/L);滤羧的体积,单位为毫升（ml.)：10-3
mL换算成L的系数；
样品的重量，单位为克（g）。
+( 1 )
（2）
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SN/T 3949—2014
检测限
滤液的检测下限为0.2μg/L;样品双酚A的检测下限为2×10μ/。滤液的检测上限为20g/L;样品双酚A的检测下限为0.4g/g
9精密度
在重友性条件下，获得两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
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