SN/T 4675.12-2016.Determination of lysozyme in wine for export-HPLC method.
1范围
SN/T 4675.12规定了葡萄酒中溶菌酶含量的高效液相色谱测定方法。
SN/T 4675.12适用于白葡萄酒和起泡葡萄酒中溶菌酶含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
本方法只检测葡萄酒中具有酶活性的溶菌酶的含量,但与蛋白质中酶真实的活性无关。葡萄酒中的溶菌酶经反相苯基柱分离后,用高效液相色谱荧光检测器或紫外检测器测定,保留时间定性,外标法定量。
4试剂和材料
4.5三氟乙酸(TFA)。
4.65% 盐酸溶液:量取5 mL盐酸,用水定容至100 mL。
4.7酒石 酸溶液:称取1.0 g酒石酸(4.4),用100 mL无水乙醇溶解,用水定容至1 000 mL。
4.8 溶菌酶标准物质(CAS:12650-88-3)。
4.9溶菌酶标准储备液:准确称取适量的溶菌酶标准品(4.8),加适量酒石酸溶液(4.7)超声震荡使其充分溶解并定容至刻度,配制成浓度为2 μL的标准储备液,保存在0 °C~4 °C的冰箱中。
4.10 溶菌酶标准工作溶液:分别准确量取溶菌酶标准储备溶液(4.9),用样品提取液稀释,配制成5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、25.0 mg/L、40.0 mg/L、50.0 mg/L、60.0 mg/L的标准工作溶液,现配现用。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4675.122016
出口葡萄酒中溶菌酶的测定
液相色谱法
Determination of lysozyme in wine for export-HPLC method2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂屋造真
2017-07-01实施
SN/T4675《出口葡萄酒质量安全分析方法》共分为30个部分：SN/T4675.1：出口葡萄酒中甘油的测定酶法；SN/T4675.2：出口葡萄酒中23-丁二醇的测定气相色谱法；SN/T4675.3：出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定：SN/T4675.4：出口葡萄酒中乳酸的测定酶法：SN/T4675.5：出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谱法；SN/T4675.6：出口葡萄酒中葡萄糖、果糖和燕糖的测定：SN/T4675.7：出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法：SN/T4675.8：出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法；-SN/T4675.9：出口葡萄酒中二甘醇的测定气相色谱质谱法；SN/T4675.12—2016
SN/T4675.10：出口葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法；-SN/T4675.11：出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法；SN/T4675.12：出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法；SN/T4675.13：出口葡萄酒中2.4.6二氯甲苯醚残留量的测定气相色谱质谱法；SN/T4675.14：出口葡萄酒中纳他霉素的测定液相色谱-质谱/质谱法；SN/T4675.15：出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸和对氟苯甲酸的测定液相色谱法：SN/T4675.16：出口葡萄酒中富马酸的测定液相色谱质谱/质谱法；SN/T4675.17：出口葡萄酒中丁基锡含量的测定气相色谱-质谱/质谱法：SN/T4675.18：出口葡萄酒中二硫代氨基中酸酯残留量的测定项空气相色谱法；SN/T4675.19：出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、铜、锌、砷、硒、银、镉、铅的测定：SN/T4675.20：出口葡萄酒中稀土元索的测定电感耦合等离子体质谱法；SN/T4675.21：出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法；SN/T4675.22：出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法：SN/T4675.23：出口葡菊酒及葡萄汁中氮氮的测定连续流动分析仪法；SN/T4675.24：出口前萄酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法：SN/T4675.25：出口葡萄酒颜色的测定CIE1976（Lab*）色空间法；SN/T4675.26：出口葡萄酒浊度的测定散射光法；SN/T4675.27：出口葡萄酒碱性灰分的测定；SN/T4675.28：出口葡萄酒细菌、霉菌及酵母的计数；SN/T4675.29：出口葡萄酒中酒香酵母检验实时荧光PCR法；SN/T4675.30：出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验实时荧光PCR法。本部分为SN/T4675的第12部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分修改采用国际葡萄与葡药酒组织（OIV)的OIV-MA-AS315-14《葡萄酒中溶菌酶的测定-液相色谱法》。本部分在技术内容上与该方法致，仅对OIV的方法OIV-MA-AS315-14的个别内容作了编辑性修改，修改的主要内容为：色谱条件的优化。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。SN/T4675.12—2016
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：庞世琦、刘青、潘内珍、梁瑞婷、陈秀明、刘朝霞、李志勇、韩深、田玲、宦萍。1范围
出口葡萄酒中溶菌酶的测定
SN/T4675.12—2016
液相色谱法
SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中溶菌酶含量的高效液相色谱测定方法。本部分适用于白葡药酒和起泡葡萄酒中溶菌酶含量的测定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是江日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
本方法只检测葡萄酒中具有酶活性的溶菌酶的含量，但与蛋白质中酶真实的活性无关。葡萄酒中的溶菌酶经反相苯基柱分离后，用高效液相色谱荧光检测器或紫外检测器测定，保留时间定性，外标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯水采用GB/T6682规定的级水。4.1
乙（C,H.N）：色谱纯。
无水乙醇（CH,O)。
盐酸（HCL）。
酒石酸（C,H,O）。
三氟乙酸（TFA）。
4.65%盐酸溶液：量取5ml盐酸，用水定容至100mL。4.7
酒石酸溶液：称取1.0g酒石酸（4.4），用100mL无水乙醇溶解，用水定容至1000ml。4.8溶菌酶标准物质（CAS：12650-88-3）。4.9溶菌酶标准储备液：准确称取适量的溶菌酶标准品（4.8），加适量酒石酸溶液（4.7)超声震荡使其充分溶解并定容至刻度，配制成浓度为2L的标准储备液，保存在0℃～4℃的冰箱中。4.10溶菌酶标准工作溶液：分别准确量取溶菌酶标准储备溶液（4.9），用样品提取液稀释，配制成5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L25.0mg/L、40.0mg/L.50.0mg/L.60.0mg/L的标准T作溶液，现配现用
4.11微孔滤膜：0.22μm，水系。5仪器和设备
高效液相色谱仪：具有荧光检测器或紫外检测器。5.1
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SN/T 4675.12—2016
2水平振荡器。
5.3超声波水浴。
涡旋混合器。
分析天平；感量0.1mg。
6测定步骤
用移液管准确量取10.0mL.试样（起泡酒需预先脱气，将100mL试样倒入带排气寒的瓶中，在室温下使用水平振荡器或超声波水浴脱气，直至无气泡逸出。）于100mL容量瓶中，用5%盐酸（4.6)稀释至刻度并酸化5min，再经滤膜（4.11)过滤，收集滤液待测。6.2
液相色谱参考条件
色谱柱：反相苯基柱，疏水层析凝胶反向色谱柱，7.5cmX4.6mm或相当者；柱温：30℃：
流动相：A：CH.CN50%，FA0.2%H.O49.8%B:CH,CN1%.TFA0.2%.H,O98.8%;
流速：0.8mL/min；
进样量：50；
检测波长：紫外波长：280um；
荧光波长：激发波长（入ex）：276nm；发射波长（入em）：345nm；
梯度洗脱程序见表1：
时间/min
液相色谱测定
梯度洗脱程序
流动A/%
流动B/%
按照上述色谱条件，分别对标准工作液和样品试液进样检测，以保留时间对样品进行定性，采用外标法定量。待测样液中溶菌酶的响应值应在仪器线性响应范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分2
TYKAoNiKAca
SN/T4675.12—2016
析。溶菌酶的参考保留时间为24.5min土0.6min，标准物质的色谱图参见附录A。6.3空白试验
除不加样品试液外，均按上述步骤进行。结果计算和表述
试样中溶菌酶的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得，计算结果应扣除空白值：CXV
式中：
X一试样中待测物的含量，单位为毫克每升（mg/L）；标准溶液中待测物的浓度，单位为毫克每升（mg/L)；V
样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：V—试样的取样体积，单位为毫升（mL）。计算结果保留至小数点后一位。8方法的定量限和回收率
8.1定量限
本方法的定量限：50.0mg/L。
回收率
在四个添加浓度范围内，白葡萄酒、起泡葡萄酒中溶菌酶的回收率数据参见附录B。9精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过其算术平均值的5%。..（1)
rYKAoNiTKAca
SN/T4675.12—2016
附录A
（资料性附录）
色谱图
高效液相色谱法荧光检测器测定溶菌酶的典型色谱图见图A.1。150000-
50000-
180020002200240026002800300032003400360038004000400600
8001000120014001600
高效液相色谱法荧光检测器测定溶菌酶的典型色谱图（浓度为100mg/L）高效液相色谱法紫外检测器测定溶菌酶的典型色谱图见图A.22000-
nv/各
—1000-
200400 600 800 10001200140016001800200022002400260028003000320034003600380040000
高效液相色谱法紫外检测器测定溶菌酶的典型色谱图（浓度为100mg/L）-TrKAONrKAca
附录B
（资料性附录）
不同基质中溶菌酶不同添加水平回收率数据不同基质中溶菌酶不同添加水平回收率数据见表B.1。表B.1
化合物
溶菌酶
（荧光检测器检测）
溶菌酶
（紫外检测器检测）
不同基质中溶菌酶不同添加水平回收率数据添加水平
白葡萄酒
均国收率
91.8~-96.0
91.3--98.7
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起泡酒
平均回收率
91.2~96.0
92.4~94.8
90.5~97.6bZxz.net
90.6~96.6
90.6~98.6
92.0-~96.8
90.0~97.2
95.0~99.3
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SN/T4675.12-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口葡萄酒中溶菌酶的测定
液相色谱法
SN/T4675.12—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张0.75字数14千字
2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1-500
书号：155066：2-32301
定价16.00元
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