SN/T 4723-2016
基本信息
标准号： SN/T 4723-2016
中文名称：根结线虫属(非中国种)检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4723-2016.Detection and identification of Meloidog yne spp. ( non-Chinese species).
1范围
SN/T 4723规定了根结线虫Meloidogyne中国种与非中国种的检疫鉴定方法。
SN/T 4723适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 24829毛 刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法
SN/T 1157进出境植物苗木检疫规程
SN/T2117伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法
3根结线虫属线虫基本信息
学名:Meloidogyne Goeldi,1887
英文名:Root-knot nematodes
分类地位:垫刃目( Tylenchida),垫刃总科( Tylenchoidea)，纽带科( Hoplolaimidae),根结亚科(Meloidogyninae) ,根结线虫属(Meloidogyne )
传播途径:带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运;农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。
1范围
SN/T 4723规定了根结线虫Meloidogyne中国种与非中国种的检疫鉴定方法。
SN/T 4723适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 24829毛 刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法
SN/T 1157进出境植物苗木检疫规程
SN/T2117伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法
3根结线虫属线虫基本信息
学名:Meloidogyne Goeldi,1887
英文名:Root-knot nematodes
分类地位:垫刃目( Tylenchida),垫刃总科( Tylenchoidea)，纽带科( Hoplolaimidae),根结亚科(Meloidogyninae) ,根结线虫属(Meloidogyne )
传播途径:带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运;农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4723—2016
根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法Detection and identification of Meloidogyne spp.(non-Chinese species)2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
途滋电典物
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4723—2016
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、南京农业大学、华南农业大学。本标准主要起草人：顾建锋、王金成、何洁、张慧丽、王暄喧、李芳荣、林宇、卓侃。1范围
根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法本标准规定了根结线虫Meloidogyne中国种与非中国种的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。2规范性引用文件
SN/T4723—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24829毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法进出境植物苗木检疫规程
SN/T1157
SN/T 2117
伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法3根结线虫属线虫基本信息
学名：MeloidogyneGoeldi,1887英文名：Root-knotnematode
分类地位：垫刃日（Tylenchida），垫刃总科（工ylenchoidea），纽带科（Hoplolaimidae），根结亚科（Meloidogyninae），根结线虫属（Melaidogyne）传播途径：带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运；农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。
根结线虫属其他相关信息参见附录A。根结线虫属线虫为植物根系，球根、球茎等地下组织的专性内奇生线虫，其寄主及分布范围均十分广泛。目前该属已知线虫98种，其中最常见的是南方根结线虫M.incognita、花生根结线虫M.arenaria，爪哇根结线虫M.jauanica，北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.erterolobii，我国已有记录近40种，其中23种确定为中国种（参见附录B）。方法原理
根结线电二龄幼电线形·在根及根围士壤中活动，侵寄主根部后固着寄生，逐渐发为卵圆形雕虫，导致寄主根部膨大呈根瘤状。因此，如发现疑似根结，可直接剖检获得雌虫，也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后，根据其雌虫、雄虫和二龄幼虫形态，判别其是否为根结线虫属，然后进一步用形态学和分子生物学相结合的方法，并参考其寄主、地理分布等信息，判断其种类，
目前已经报道的根结线虫共98种，其中40种在我国曾有报道。根据文献报道频次、分布是否广泛、描述是否充分等，将其中23种作为中国种，其余17种是否为中国种有待进一步核实。若判断其非1
SN/T4723—2016
该方法所述的23种中国种之一，根据检疫风险原则，可判定为非中国种，并应联系有关鉴定专家进行鉴定。
5器材和试剂
5.1仪器设备和器具
PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、微波炉、烘箱：漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调式微量移液器（2μL~1000L)及相应的吸头。5.2
主要试剂
除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、2×TaqMasterMix预混液、10×EasyTaq缓冲液、蛋白酶K（20mg/mL）、无RNase无菌水、100bpMarker、EB染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。现场检疫与取样
6.1症状检查
现场检疫时应挖取寄主植物根部，观察根上是否有根结或疙瘩状变异，或生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。
6.2取样
按照SN/T2117进行抽样和取样，对有根结等症状的重点取样。如无症状，则随机取样。对于进境苗木，如数量≤5株，要求对每株单独取1份样品。每份样品重量≥0.5kg，取样深度为20cm左右，要求多带些根，数量>5株，则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中，标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息，及时送实验室检测。如小苗带土较少，则尽可能多取根和土样，不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法7
实验室检验
7.1线虫分离
实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离，可将样品暂时保存于4℃冷藏箱中土壤、介质等可用改良漏斗法分离线虫（见GB/T24829），根结可直接检分离线虫（见SN/T2117）7.2体视显微镜镜检
根结线虫二龄幼虫较细小，体长多在400μm～500um，行动缓，虫体一般内容物较多，颜色偏深。雄虫体长达1500um，行动迟缓。雌虫须剖开根结才能看到，呈球形或近梨形，长500um~700um宽300um~500um，乳白色半透明状7.3标本制作
若镜检发现二龄幼虫或雄虫，需制作临时玻片或永久玻片（见GB/T24829）。若发现雌虫，应制作会阴花纹永久玻片（见SN/T2117）。2
TKAONiKAca
7.4生物显微镜观察、摄影和测量SN/T4723--2016
仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微摄影，主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态，雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态，背食道腺开口到口针基球的距离（dorsalglandorifice，简称DGO)，以及二龄幼虫的体长、口针长度及基部球形态、尾形及透明区长度等特征。应在每张图片上加相应标尺，测量并计算：体长/虫体最宽处体宽（a）、体长/食道腺体长度（b）、体长/尾长（e）、尾长/肛门处虫体直径（c）、阴门至头端的长度/体长×100（V）等值（根结雌虫一般不测V值，测阴门裂长和肛阴距等）。如样品足够，应测量雌虫、雄虫、二龄幼虫各20条以上。8形态学鉴定
8.1根结线虫属形态鉴定
8.1.1雌虫
虫体梨形到球形，具突出的短颈，白色，静止不动，无孢囊期；长350um~3mm，宽300um~700μm。阴门和肛门位于末端，无尾；会阴部具指纹状花纹，一般平，较少有突起；侧尾腺口点状，位于肝门两侧略靠前的位置；角质层具环纹；口针细弱，一般12μm～15um，基部球小；排泄孔位于中食道球前，通常位于口针基部稍后位置；双生殖腺，前伸，在虫体内盘绕；雌虫卵不留在体内，而是产在一个胶质囊内。
8.1.2雄虫
蟠虫形，体长可达2mm，尾末端扭曲；角质层环纹明显，侧区有4条刻线；唇区缢缩不明显，但具明显的唇盘，唇环较少，1条~3条；口针强壮，18um25pm长，基部球大：食道腺主要从腹面覆盖肠：交合刺较细弱，一般25μm~33um长，引带长7μm～11um；单精巢；尾端圆，侧尾腺口圆点状，位于肛门附近；无交合伞。
8.1.3二龄幼虫
端虫形，具环纹，长250m~600um。头部结构与雄虫相似，但小很多，头架轻微骨化，唇区缢缩不清晰，有1个4个不清晰的唇环，口针弱，不长于20um，基部球显着膨大，中食道球较大，瓣门清晰，排泄孔位于半月体后，透明尾明显，尾末端窄，不规则。8.1.4与孢囊线虫属区别
根结线虫属和孢囊线虫属比较近似，其区别参见附录C。8.2根结线虫属的判定
发现雌虫、雄虫或二龄幼虫符合上述形态特征，主要根据成熟雌虫寄生于根内；雌虫尾末端不突起具会阴花纹；雄虫唇区骨化弱、口针较弱；二龄幼虫虫体细、口针细弱、透明尾较短等特征，可判定为根结线虫属(参见附录C)。
8.3根结线虫中国种形态鉴定
判定为根结线虫属后，可以根据23种根结线虫中国种形态特征描述（参见附录D）和线描图（参见附录E)对其进行形态学鉴定。
-TKAONKAca
SN/T4723—2016
9分子生物学鉴定
9.1多重PCR方法
多重PCR方法具体操作步骤参见附录F。9.2种特异PCR方法
种特异PCR方法具体操作步骤参见附录G。线粒体DNA限制性内切酶片段长度多态性9.3
mtDNA-RFLP方法具体操作步骤参见附录H9.4DNA条形码方法
DNA条形码方法具体操作步骤参见附录I10鉴定流程及结果判定
RFLP方法）
当从根围土壤或介质中获得根结线虫二龄幼虫或雄虫，或是发现根结后副检获得雕虫后，应进一步分离检测，尽量找齐摊、雄虫和二龄幼虫等3种虫态，以便开展形态学鉴定和分子生物学鉴定。首先参照附录C，判断其是否为根结线虫属。鉴于南方根结线虫、花生根结线虫、瓜哇根结线虫、北方根结线虫和象耳豆根结线虫的发生较为普遍，可先针对这5种线虫开展种特异PCR检测、多重PCR检测或mtDNA-RFLP检测。如检测结果为文，则可确定其种类。如检测结果均为阴性或与目标酶切片段大小不一阳性，或与日标酶切片段大小一致致，可进一步以28S基因作为DNA条形码基因，测序后进行DNA序列分析，可对多数根结线虫属线虫进行鉴定：
要判断待检样品是否为非中国种，应先将其鉴定到种。由于根结线虫属内各种形态特征非常近似，单凭形态学方法很难鉴定到种。如该种线虫为实验室首次截获，或该种线虫之前在其来源国或寄主上未见报道，通常需要将形态学方法与多种不同的分子生物学方法互相印证，才能做出准确的鉴定结论。11记录和标本样品保存
若鉴定为根结线虫（非中国种），应将剩余的线虫杀死、固定后制成永久玻片保存；可用4%甲醛固定后于指形管中长期保存。应保存的记录信息包括样品编号、为害症状（包括相关照片）、被感染材料的状态和来源、经鉴定的有害生物学名、测计数据、显微照片、标本鉴定人、鉴定时间、制作人、制作时间等信息。
对含有线虫的剩余样品材料，经登记后妥善保存。保存期至少为6个月，期满后视情况作销毁处理。
TYKAONKAca
A.1生物学特性
附录A
（资料性附录）
根结线虫属其他相关信息
SN/T4723—2016
根结线虫雌虫将卵产在胶质卵块中，卵块通常见于根结的表面，但也可包埋于根结组织中。卵块最初软、粘、透明，以后逐渐变得结实，同时颜色变暗。条件适宜时，1龄幼虫在卵内蜕皮发育成二龄幼虫。二龄幼虫可在土壤中移动，找到合适的寄主后，可侵人根组织，随后在根内建立永久的取食位点，诱导根部细胞形成巨细胞。巨细胞诱导形成后，二龄幼虫不再移动，虫体膨大为香肠形。条件适宜的情况下，大约14d后，二龄幼虫蜕皮变成3龄幼虫，然后蜕皮变成4龄幼虫，再蜕皮变成成虫。二龄幼虫和成虫存在时间较长，而3龄和4龄幼虫总共存在的时间为4d-63龄和4龄幼虫没有口针，不取食：雄虫蠕虫形，不取食，一般在虫口密度很高或食物缺乏等不利于雌虫发育的条件下形成除少数根结线虫属线虫为两性生殖外，大部分根结线虫属线虫为孤雌生殖的，从而其生活周期更短、繁殖率更高，更有利于其成为植物病原，生态学特性
A.2.1地理分布
根结线虫可从地理分布分为温暖地区种类和寒冷地区种类，奇氏根结线虫M.chitoodi、北方根结线虫M.hapla、纳西根结线虫M.maasz等为寒冷地区种类，能在土壤平均温度低于10℃条件下生a花生根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、短小根结线存，而南方根结线虫M.incognita虫M.erigua等都是温暖地区种类，不能在土壤平均温度低于10C条件下生存。4种最常见根结线虫，即南方根结线虫M
ncognita
javanica和北方根结线虫M.hapla，为世界性分chituoodi，埃塞俄比亚根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.
花生根结线虫
有些根结线
虫种类，如奇氏根结线虫M.
Tethiopica、虚假根结线虫M.fallar、拟禾本科根结线虫M.gra-minicola、短小根结线虫Merigua、象耳豆根结线虫M.enterolotii分布范围相对较窄。还有一些种类分布非常局限，如高粱根结线虫M.acronea只在南部非洲有发现，巴拉那根结线虫M.paranaensis仅在巴西、危地马拉报道。
A.2.2寄主范围
根结线虫为专性寄生线虫，寄主范围极为广泛，可侵染几千种不同的植物，包括单子叶植物和双子叶植物，草本植物和木本植物。热带、亚热带和温带地区的多种粮食作物、蔬菜、水果、观赏植物均可受根结线虫侵染。与分布范围相似，根结线虫不同种类的寄主范围差异明显。最常见4种根结线虫寄主极为广泛，而有的线虫种类寄主非常有限，如埃塞俄比亚根结线虫M.ethiopica只寄生葡萄、猕猴桃、大豆和甘熊。
A.2.3为害症状
根结线虫危害寄主植物根部，一般地上部分不表现明显症状。但当植株在生长早期被大量根结线虫危害根部时，植株地上部分可矮化、变色、枯萎、长势不良等症状，导致结实不良，严重时成片死亡。rikAoNrKAca
SN/T4723—2016
根结线虫危害症状主要在根部。拔起病株，去除根系附着的土壤，可见根上长有根结。初期根结只有针尖大小，随着不断生长，其体积可增大到根直径的数倍。根结形态与线虫种类及寄主有关。例如：三叶草根结线虫Meloidogynetrifoliophila引起的根结瘦长，瓜类植物上的根结一般十分明显，一些禾本科植物上不形成根结，木本植物上的根结往往很小。6
-TKAONIKAca
根结线虫中文名
猕猴桃根结线虫
花生根结线虫
柑橘根结线虫
龙眼根结线虫
东海根结线虫
象耳豆根结线虫
繁峙根结线虫
福建根结线虫
拟禾本科根结线虫
禾本科根结线业
海南根结线虫
北方根结线虫
西班牙根结线虫
南方根结线虫
爪哇根结线虫
简阳根结线虫
济南根结线虫
孔氏根结线虫
林氏根结线虫
闽南根结线虫
番禺根结线虫
悬铃木根结线虫
中华根结线虫
（资料性附录）
根结线虫名录
23种根结线虫（中国种）名录
Mactinidiae Li&Yu, 1991
M.arenaria(Neal,1889)Chitwood,1949M.citri Zhang,Gao &Weng.1990M.dimocarpusLiu&.Zhang,2001
M.donghaiensis Zheng,Lin &Zheng,1990Menterolobii Yang &Eisenback,1983M.fanzhiensis Chen,Peng&Zheng,1990M.fujianensis Pan, 1985
M.graminicola Golden&Birchfield,1965M.graminis(Sledge&.Golden，1964)Whitehead,1968M.hainanensis Liao &Feng,1995M.hapla Chitwood, 1949
M.hispanica Hirschmann,1986
M.incognita(Kofoid&White,1919)Chitwood,1949M.javanica(Treub,1885)Chitwood，1949M.jianyangensis Yang,Hu,Chen &Zhu,1990M.jinanensis Zhang &. Su, 1986M.kongi Yang,Wang&Fcng,1988
M.lini Yang,Hu &.Xu,1988
M.mingnanica Zhang,1993
M.panyuensisLiao,Yang,Feng &Karssen,2005M.plataniHirschmann,1982
M.sinensis Zhang,1983
SN/T4723—2016
SN/T4723—2016
根结线虫中文名
高粱根结线虫
非洲根结线虫
水生根结线虫
阿拉伯根结线虫
阿登根结线虫
甘蓝根结线虫
贝特根结线虫
巴西利亚根结线虫
短尾根结线虫
加利福尼亚根结线虫
山茶根结线虫
锦鸡儿根结线虫
卡罗莱纳根结线虫
奇氏根结线虫
钻天柳根结线虫
克里斯蒂根结线虫
咖啡根结线虫
十字形根结线虫
洋蓟根结线虫
光纹根结线虫
丘根结线虫
迪茨根结线虫
埃塞俄比亚根结线虫
短小根结线虫
伪根结线虫
佛罗里达根结线虫
德州花生根结线虫
户根结线虫
印度根结线虫
无饰根结线虫
伊萨尔科根结线虫
吉库尤根结线虫
根结线虫（非中国种）名录
Meloidogyne acronea Coetzee, 1956M.africana Whitehead,1960
M,aquarilisEbsary &Eveleigh,1983M.arabicida Lopez &Salazur:1989M.ardenensis Santos, 1968
Mariellia Franklin,1961
M.bnetica Castillo,Vovlas,SubbotinM.brasalenssCharchar
M.brevicauda L
roccoli,2003
&Eisenback. 2002
M.californiasisAbdel Rabman &Maggenti,1987M.co
eltiae Golden
caragunde Sha
alinaIvanova SKrall
M.carolimensisEisenback,1982.chitzeiondiGolden.o'Bannon,SantoM.chosenia Eroshenko &
Golden
leva1992
Kaplan.1986
dello&Zamith.1980
ZaLord
Gardia Martin
riensis
alineata
Pastillo,2037
Finley.1980
sylor&
Smart，1982
Whitehes
Paolom
duvsikarss
vanAelst
Whitehead,1958
M.erigua Goldi,1887
M.fallar Karssen, 1996
Vovlas
Troccoli,
derPutten,1998
Liebanas,
M.fioridensis Handoo, Nyczepir,Esmenjaud, van der Beek, CastagnoneSereno，Carta，Skantar&.Higgins，2004M.haplanaria Eisenback,Bernard,Starr,Lee &.Tomaszewski,2004M.ichinohei Araki, 1992
M.indica Whitehead.1968
M.inornata Lordello,1956al
M.izalcoensis Carneiro,Almeida,Gomes&Hernandez,2005M.kikuyensis De Grisse. 1g61编号
根结线虫中文名
科纳根结线虫
克氏根结线虫
吕克根结线虫
橄榄根结线虫
苹果根结线虫
海根结线虫
马里兰根结线虫
巨大根结线虫
巨球根结线虫
红树根结线虫
小头根结线虫
小窦根结线虫
小根结线虫
摩洛哥根结线虫
纳西根结线虫
纳托根结线虫
水稍根结线虫
欧氏根结线虫
草根结线虫
卵形根结线虫
巴拉那根结线虫
裂垫根结线虫
矮牵牛根结线虫
菜豆根结线虫
松根结线虫
胡椒根结线虫
皮西根结线虫
多头环根结线虫
前孔根结线虫
栎根结线虫
萨拉斯根结线虫
表B.2（续）
M.konaensis Eisenback,Bernard & Schmitt.I1995M.kralli Jepson,1984
SN/T4723—2016
Almeida,Gomes,Deimi, Castagnone-sereno &M.luci Carneiro,
Correa，
Karssen,2014
M.iusitanica Abrantes &.Santos,1991M.umatiItoh,OhshimaoLehinohe.196Mmaritima Jepson.1987
Mmarytandi Jep
M.megadoru Whin
M.megatyla
Golden n Jepse
n，1987
Baldwin&Se
Siddiqi
M.microrephalu
1：1979
th1991
M.mterotyk Mulvey.Townshend &.PoBok
ter1975
Molendijk,Zijlstra,van Hoof &Cook,2004M.
FiensisRa
Frankli
mmah & Hirsel
ueGolden,Ros
zaeMaa
pifai Elmiligy,
Mouatts Riffle,19
M-paranaesis
ann，1990bzxZ.net
Bird.1981
1969)E
rneiro，Ce
erneiro
M.parutyta Kleynhans,198sb
Kox，
Korthals
Abrantes,Santos&Almeida,1996M.petuniaeCharchar,Eisenback &-Hirschmann,1999M.phaseoli Charchar,Eisenback,Charchar &Boiteau,2008bM.pini Eisenback,Yang &.Hartman,1985M.piperi Sahoo,Ganguly&Eapen,2000M.pisi Charchar,Eisenback, Charchar & Boiteau,2008aM. polycephannulala
Boiteux,2009
Charchar,
M.propora Spaull, 197?
M.querciana Golden,1979
M.salasz Lopez,1984
Eisenback,
Vieira,
Fonscca-boiteux,
SN/T4723-—2016
根结线虫中文名
萨瑟根结线虫
休氏根结线虫
北欧根结线虫
透明根结线虫
亚北方根结线虫
苏吉那姆根结线虫
塔吉克根结线虫
泰国根结线虫
三叶草根结线虫
麦稻根结线虫
十耳其斯坦根结线虫
范氏根结线虫
表B.2（续）
M.sasseri Handoo,Huettel &Golden,1994M.sewelliMulvey&Anderson, 1980M.siluestris Cestillo, Vovlas, Troccoli, Liebanas,PalomaresRivs
Landa,20c9
M.spartinae (Rau &Fassuliotis, 1965)Whitehead.1968M.suburetica Bernard,1981
M.suginamiensis Toida&Yaegashi,1984M.tadshikistanica Kirjanova & Ivanova.1965M.thailandicaHandoo,Skantar,Carta&Erbe,2005M.trifoliophila Bernard &.Eiscnback,1997M.triticoryzae Gaur,Saha &Khan, 1993M.turkestanica Shagalina, Ivanova &Krall, 1985M.uandervegleiKleynhans,1988
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
途滋电典物
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4723—2016
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、南京农业大学、华南农业大学。本标准主要起草人：顾建锋、王金成、何洁、张慧丽、王暄喧、李芳荣、林宇、卓侃。1范围
根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法本标准规定了根结线虫Meloidogyne中国种与非中国种的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。2规范性引用文件
SN/T4723—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24829毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法进出境植物苗木检疫规程
SN/T1157
SN/T 2117
伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法3根结线虫属线虫基本信息
学名：MeloidogyneGoeldi,1887英文名：Root-knotnematode
分类地位：垫刃日（Tylenchida），垫刃总科（工ylenchoidea），纽带科（Hoplolaimidae），根结亚科（Meloidogyninae），根结线虫属（Melaidogyne）传播途径：带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运；农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。
根结线虫属其他相关信息参见附录A。根结线虫属线虫为植物根系，球根、球茎等地下组织的专性内奇生线虫，其寄主及分布范围均十分广泛。目前该属已知线虫98种，其中最常见的是南方根结线虫M.incognita、花生根结线虫M.arenaria，爪哇根结线虫M.jauanica，北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.erterolobii，我国已有记录近40种，其中23种确定为中国种（参见附录B）。方法原理
根结线电二龄幼电线形·在根及根围士壤中活动，侵寄主根部后固着寄生，逐渐发为卵圆形雕虫，导致寄主根部膨大呈根瘤状。因此，如发现疑似根结，可直接剖检获得雌虫，也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后，根据其雌虫、雄虫和二龄幼虫形态，判别其是否为根结线虫属，然后进一步用形态学和分子生物学相结合的方法，并参考其寄主、地理分布等信息，判断其种类，
目前已经报道的根结线虫共98种，其中40种在我国曾有报道。根据文献报道频次、分布是否广泛、描述是否充分等，将其中23种作为中国种，其余17种是否为中国种有待进一步核实。若判断其非1
SN/T4723—2016
该方法所述的23种中国种之一，根据检疫风险原则，可判定为非中国种，并应联系有关鉴定专家进行鉴定。
5器材和试剂
5.1仪器设备和器具
PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、微波炉、烘箱：漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调式微量移液器（2μL~1000L)及相应的吸头。5.2
主要试剂
除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、2×TaqMasterMix预混液、10×EasyTaq缓冲液、蛋白酶K（20mg/mL）、无RNase无菌水、100bpMarker、EB染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。现场检疫与取样
6.1症状检查
现场检疫时应挖取寄主植物根部，观察根上是否有根结或疙瘩状变异，或生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。
6.2取样
按照SN/T2117进行抽样和取样，对有根结等症状的重点取样。如无症状，则随机取样。对于进境苗木，如数量≤5株，要求对每株单独取1份样品。每份样品重量≥0.5kg，取样深度为20cm左右，要求多带些根，数量>5株，则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中，标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息，及时送实验室检测。如小苗带土较少，则尽可能多取根和土样，不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法7
实验室检验
7.1线虫分离
实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离，可将样品暂时保存于4℃冷藏箱中土壤、介质等可用改良漏斗法分离线虫（见GB/T24829），根结可直接检分离线虫（见SN/T2117）7.2体视显微镜镜检
根结线虫二龄幼虫较细小，体长多在400μm～500um，行动缓，虫体一般内容物较多，颜色偏深。雄虫体长达1500um，行动迟缓。雌虫须剖开根结才能看到，呈球形或近梨形，长500um~700um宽300um~500um，乳白色半透明状7.3标本制作
若镜检发现二龄幼虫或雄虫，需制作临时玻片或永久玻片（见GB/T24829）。若发现雌虫，应制作会阴花纹永久玻片（见SN/T2117）。2
TKAONiKAca
7.4生物显微镜观察、摄影和测量SN/T4723--2016
仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微摄影，主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态，雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态，背食道腺开口到口针基球的距离（dorsalglandorifice，简称DGO)，以及二龄幼虫的体长、口针长度及基部球形态、尾形及透明区长度等特征。应在每张图片上加相应标尺，测量并计算：体长/虫体最宽处体宽（a）、体长/食道腺体长度（b）、体长/尾长（e）、尾长/肛门处虫体直径（c）、阴门至头端的长度/体长×100（V）等值（根结雌虫一般不测V值，测阴门裂长和肛阴距等）。如样品足够，应测量雌虫、雄虫、二龄幼虫各20条以上。8形态学鉴定
8.1根结线虫属形态鉴定
8.1.1雌虫
虫体梨形到球形，具突出的短颈，白色，静止不动，无孢囊期；长350um~3mm，宽300um~700μm。阴门和肛门位于末端，无尾；会阴部具指纹状花纹，一般平，较少有突起；侧尾腺口点状，位于肝门两侧略靠前的位置；角质层具环纹；口针细弱，一般12μm～15um，基部球小；排泄孔位于中食道球前，通常位于口针基部稍后位置；双生殖腺，前伸，在虫体内盘绕；雌虫卵不留在体内，而是产在一个胶质囊内。
8.1.2雄虫
蟠虫形，体长可达2mm，尾末端扭曲；角质层环纹明显，侧区有4条刻线；唇区缢缩不明显，但具明显的唇盘，唇环较少，1条~3条；口针强壮，18um25pm长，基部球大：食道腺主要从腹面覆盖肠：交合刺较细弱，一般25μm~33um长，引带长7μm～11um；单精巢；尾端圆，侧尾腺口圆点状，位于肛门附近；无交合伞。
8.1.3二龄幼虫
端虫形，具环纹，长250m~600um。头部结构与雄虫相似，但小很多，头架轻微骨化，唇区缢缩不清晰，有1个4个不清晰的唇环，口针弱，不长于20um，基部球显着膨大，中食道球较大，瓣门清晰，排泄孔位于半月体后，透明尾明显，尾末端窄，不规则。8.1.4与孢囊线虫属区别
根结线虫属和孢囊线虫属比较近似，其区别参见附录C。8.2根结线虫属的判定
发现雌虫、雄虫或二龄幼虫符合上述形态特征，主要根据成熟雌虫寄生于根内；雌虫尾末端不突起具会阴花纹；雄虫唇区骨化弱、口针较弱；二龄幼虫虫体细、口针细弱、透明尾较短等特征，可判定为根结线虫属(参见附录C)。
8.3根结线虫中国种形态鉴定
判定为根结线虫属后，可以根据23种根结线虫中国种形态特征描述（参见附录D）和线描图（参见附录E)对其进行形态学鉴定。
-TKAONKAca
SN/T4723—2016
9分子生物学鉴定
9.1多重PCR方法
多重PCR方法具体操作步骤参见附录F。9.2种特异PCR方法
种特异PCR方法具体操作步骤参见附录G。线粒体DNA限制性内切酶片段长度多态性9.3
mtDNA-RFLP方法具体操作步骤参见附录H9.4DNA条形码方法
DNA条形码方法具体操作步骤参见附录I10鉴定流程及结果判定
RFLP方法）
当从根围土壤或介质中获得根结线虫二龄幼虫或雄虫，或是发现根结后副检获得雕虫后，应进一步分离检测，尽量找齐摊、雄虫和二龄幼虫等3种虫态，以便开展形态学鉴定和分子生物学鉴定。首先参照附录C，判断其是否为根结线虫属。鉴于南方根结线虫、花生根结线虫、瓜哇根结线虫、北方根结线虫和象耳豆根结线虫的发生较为普遍，可先针对这5种线虫开展种特异PCR检测、多重PCR检测或mtDNA-RFLP检测。如检测结果为文，则可确定其种类。如检测结果均为阴性或与目标酶切片段大小不一阳性，或与日标酶切片段大小一致致，可进一步以28S基因作为DNA条形码基因，测序后进行DNA序列分析，可对多数根结线虫属线虫进行鉴定：
要判断待检样品是否为非中国种，应先将其鉴定到种。由于根结线虫属内各种形态特征非常近似，单凭形态学方法很难鉴定到种。如该种线虫为实验室首次截获，或该种线虫之前在其来源国或寄主上未见报道，通常需要将形态学方法与多种不同的分子生物学方法互相印证，才能做出准确的鉴定结论。11记录和标本样品保存
若鉴定为根结线虫（非中国种），应将剩余的线虫杀死、固定后制成永久玻片保存；可用4%甲醛固定后于指形管中长期保存。应保存的记录信息包括样品编号、为害症状（包括相关照片）、被感染材料的状态和来源、经鉴定的有害生物学名、测计数据、显微照片、标本鉴定人、鉴定时间、制作人、制作时间等信息。
对含有线虫的剩余样品材料，经登记后妥善保存。保存期至少为6个月，期满后视情况作销毁处理。
TYKAONKAca
A.1生物学特性
附录A
（资料性附录）
根结线虫属其他相关信息
SN/T4723—2016
根结线虫雌虫将卵产在胶质卵块中，卵块通常见于根结的表面，但也可包埋于根结组织中。卵块最初软、粘、透明，以后逐渐变得结实，同时颜色变暗。条件适宜时，1龄幼虫在卵内蜕皮发育成二龄幼虫。二龄幼虫可在土壤中移动，找到合适的寄主后，可侵人根组织，随后在根内建立永久的取食位点，诱导根部细胞形成巨细胞。巨细胞诱导形成后，二龄幼虫不再移动，虫体膨大为香肠形。条件适宜的情况下，大约14d后，二龄幼虫蜕皮变成3龄幼虫，然后蜕皮变成4龄幼虫，再蜕皮变成成虫。二龄幼虫和成虫存在时间较长，而3龄和4龄幼虫总共存在的时间为4d-63龄和4龄幼虫没有口针，不取食：雄虫蠕虫形，不取食，一般在虫口密度很高或食物缺乏等不利于雌虫发育的条件下形成除少数根结线虫属线虫为两性生殖外，大部分根结线虫属线虫为孤雌生殖的，从而其生活周期更短、繁殖率更高，更有利于其成为植物病原，生态学特性
A.2.1地理分布
根结线虫可从地理分布分为温暖地区种类和寒冷地区种类，奇氏根结线虫M.chitoodi、北方根结线虫M.hapla、纳西根结线虫M.maasz等为寒冷地区种类，能在土壤平均温度低于10℃条件下生a花生根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、短小根结线存，而南方根结线虫M.incognita虫M.erigua等都是温暖地区种类，不能在土壤平均温度低于10C条件下生存。4种最常见根结线虫，即南方根结线虫M
ncognita
javanica和北方根结线虫M.hapla，为世界性分chituoodi，埃塞俄比亚根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.
花生根结线虫
有些根结线
虫种类，如奇氏根结线虫M.
Tethiopica、虚假根结线虫M.fallar、拟禾本科根结线虫M.gra-minicola、短小根结线虫Merigua、象耳豆根结线虫M.enterolotii分布范围相对较窄。还有一些种类分布非常局限，如高粱根结线虫M.acronea只在南部非洲有发现，巴拉那根结线虫M.paranaensis仅在巴西、危地马拉报道。
A.2.2寄主范围
根结线虫为专性寄生线虫，寄主范围极为广泛，可侵染几千种不同的植物，包括单子叶植物和双子叶植物，草本植物和木本植物。热带、亚热带和温带地区的多种粮食作物、蔬菜、水果、观赏植物均可受根结线虫侵染。与分布范围相似，根结线虫不同种类的寄主范围差异明显。最常见4种根结线虫寄主极为广泛，而有的线虫种类寄主非常有限，如埃塞俄比亚根结线虫M.ethiopica只寄生葡萄、猕猴桃、大豆和甘熊。
A.2.3为害症状
根结线虫危害寄主植物根部，一般地上部分不表现明显症状。但当植株在生长早期被大量根结线虫危害根部时，植株地上部分可矮化、变色、枯萎、长势不良等症状，导致结实不良，严重时成片死亡。rikAoNrKAca
SN/T4723—2016
根结线虫危害症状主要在根部。拔起病株，去除根系附着的土壤，可见根上长有根结。初期根结只有针尖大小，随着不断生长，其体积可增大到根直径的数倍。根结形态与线虫种类及寄主有关。例如：三叶草根结线虫Meloidogynetrifoliophila引起的根结瘦长，瓜类植物上的根结一般十分明显，一些禾本科植物上不形成根结，木本植物上的根结往往很小。6
-TKAONIKAca
根结线虫中文名
猕猴桃根结线虫
花生根结线虫
柑橘根结线虫
龙眼根结线虫
东海根结线虫
象耳豆根结线虫
繁峙根结线虫
福建根结线虫
拟禾本科根结线虫
禾本科根结线业
海南根结线虫
北方根结线虫
西班牙根结线虫
南方根结线虫
爪哇根结线虫
简阳根结线虫
济南根结线虫
孔氏根结线虫
林氏根结线虫
闽南根结线虫
番禺根结线虫
悬铃木根结线虫
中华根结线虫
（资料性附录）
根结线虫名录
23种根结线虫（中国种）名录
Mactinidiae Li&Yu, 1991
M.arenaria(Neal,1889)Chitwood,1949M.citri Zhang,Gao &Weng.1990M.dimocarpusLiu&.Zhang,2001
M.donghaiensis Zheng,Lin &Zheng,1990Menterolobii Yang &Eisenback,1983M.fanzhiensis Chen,Peng&Zheng,1990M.fujianensis Pan, 1985
M.graminicola Golden&Birchfield,1965M.graminis(Sledge&.Golden，1964)Whitehead,1968M.hainanensis Liao &Feng,1995M.hapla Chitwood, 1949
M.hispanica Hirschmann,1986
M.incognita(Kofoid&White,1919)Chitwood,1949M.javanica(Treub,1885)Chitwood，1949M.jianyangensis Yang,Hu,Chen &Zhu,1990M.jinanensis Zhang &. Su, 1986M.kongi Yang,Wang&Fcng,1988
M.lini Yang,Hu &.Xu,1988
M.mingnanica Zhang,1993
M.panyuensisLiao,Yang,Feng &Karssen,2005M.plataniHirschmann,1982
M.sinensis Zhang,1983
SN/T4723—2016
SN/T4723—2016
根结线虫中文名
高粱根结线虫
非洲根结线虫
水生根结线虫
阿拉伯根结线虫
阿登根结线虫
甘蓝根结线虫
贝特根结线虫
巴西利亚根结线虫
短尾根结线虫
加利福尼亚根结线虫
山茶根结线虫
锦鸡儿根结线虫
卡罗莱纳根结线虫
奇氏根结线虫
钻天柳根结线虫
克里斯蒂根结线虫
咖啡根结线虫
十字形根结线虫
洋蓟根结线虫
光纹根结线虫
丘根结线虫
迪茨根结线虫
埃塞俄比亚根结线虫
短小根结线虫
伪根结线虫
佛罗里达根结线虫
德州花生根结线虫
户根结线虫
印度根结线虫
无饰根结线虫
伊萨尔科根结线虫
吉库尤根结线虫
根结线虫（非中国种）名录
Meloidogyne acronea Coetzee, 1956M.africana Whitehead,1960
M,aquarilisEbsary &Eveleigh,1983M.arabicida Lopez &Salazur:1989M.ardenensis Santos, 1968
Mariellia Franklin,1961
M.bnetica Castillo,Vovlas,SubbotinM.brasalenssCharchar
M.brevicauda L
roccoli,2003
&Eisenback. 2002
M.californiasisAbdel Rabman &Maggenti,1987M.co
eltiae Golden
caragunde Sha
alinaIvanova SKrall
M.carolimensisEisenback,1982.chitzeiondiGolden.o'Bannon,SantoM.chosenia Eroshenko &
Golden
leva1992
Kaplan.1986
dello&Zamith.1980
ZaLord
Gardia Martin
riensis
alineata
Pastillo,2037
Finley.1980
sylor&
Smart，1982
Whitehes
Paolom
duvsikarss
vanAelst
Whitehead,1958
M.erigua Goldi,1887
M.fallar Karssen, 1996
Vovlas
Troccoli,
derPutten,1998
Liebanas,
M.fioridensis Handoo, Nyczepir,Esmenjaud, van der Beek, CastagnoneSereno，Carta，Skantar&.Higgins，2004M.haplanaria Eisenback,Bernard,Starr,Lee &.Tomaszewski,2004M.ichinohei Araki, 1992
M.indica Whitehead.1968
M.inornata Lordello,1956al
M.izalcoensis Carneiro,Almeida,Gomes&Hernandez,2005M.kikuyensis De Grisse. 1g61编号
根结线虫中文名
科纳根结线虫
克氏根结线虫
吕克根结线虫
橄榄根结线虫
苹果根结线虫
海根结线虫
马里兰根结线虫
巨大根结线虫
巨球根结线虫
红树根结线虫
小头根结线虫
小窦根结线虫
小根结线虫
摩洛哥根结线虫
纳西根结线虫
纳托根结线虫
水稍根结线虫
欧氏根结线虫
草根结线虫
卵形根结线虫
巴拉那根结线虫
裂垫根结线虫
矮牵牛根结线虫
菜豆根结线虫
松根结线虫
胡椒根结线虫
皮西根结线虫
多头环根结线虫
前孔根结线虫
栎根结线虫
萨拉斯根结线虫
表B.2（续）
M.konaensis Eisenback,Bernard & Schmitt.I1995M.kralli Jepson,1984
SN/T4723—2016
Almeida,Gomes,Deimi, Castagnone-sereno &M.luci Carneiro,
Correa，
Karssen,2014
M.iusitanica Abrantes &.Santos,1991M.umatiItoh,OhshimaoLehinohe.196Mmaritima Jepson.1987
Mmarytandi Jep
M.megadoru Whin
M.megatyla
Golden n Jepse
n，1987
Baldwin&Se
Siddiqi
M.microrephalu
1：1979
th1991
M.mterotyk Mulvey.Townshend &.PoBok
ter1975
Molendijk,Zijlstra,van Hoof &Cook,2004M.
FiensisRa
Frankli
mmah & Hirsel
ueGolden,Ros
zaeMaa
pifai Elmiligy,
Mouatts Riffle,19
M-paranaesis
ann，1990bzxZ.net
Bird.1981
1969)E
rneiro，Ce
erneiro
M.parutyta Kleynhans,198sb
Kox，
Korthals
Abrantes,Santos&Almeida,1996M.petuniaeCharchar,Eisenback &-Hirschmann,1999M.phaseoli Charchar,Eisenback,Charchar &Boiteau,2008bM.pini Eisenback,Yang &.Hartman,1985M.piperi Sahoo,Ganguly&Eapen,2000M.pisi Charchar,Eisenback, Charchar & Boiteau,2008aM. polycephannulala
Boiteux,2009
Charchar,
M.propora Spaull, 197?
M.querciana Golden,1979
M.salasz Lopez,1984
Eisenback,
Vieira,
Fonscca-boiteux,
SN/T4723-—2016
根结线虫中文名
萨瑟根结线虫
休氏根结线虫
北欧根结线虫
透明根结线虫
亚北方根结线虫
苏吉那姆根结线虫
塔吉克根结线虫
泰国根结线虫
三叶草根结线虫
麦稻根结线虫
十耳其斯坦根结线虫
范氏根结线虫
表B.2（续）
M.sasseri Handoo,Huettel &Golden,1994M.sewelliMulvey&Anderson, 1980M.siluestris Cestillo, Vovlas, Troccoli, Liebanas,PalomaresRivs
Landa,20c9
M.spartinae (Rau &Fassuliotis, 1965)Whitehead.1968M.suburetica Bernard,1981
M.suginamiensis Toida&Yaegashi,1984M.tadshikistanica Kirjanova & Ivanova.1965M.thailandicaHandoo,Skantar,Carta&Erbe,2005M.trifoliophila Bernard &.Eiscnback,1997M.triticoryzae Gaur,Saha &Khan, 1993M.turkestanica Shagalina, Ivanova &Krall, 1985M.uandervegleiKleynhans,1988
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