SN/T 4613-2016.Real-time RT-PCR method for Kunjin virus detection at frontier ports.
1范围
SN/T 4613规定了昆津病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存，标本的处理和荧光RT-PCR检测。
SN/T 4613适用于昆津病毒的荧光RT-PCR检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
人间传染的病原微生物名录(中华人民共和国卫生部卫科 教发[2006]15号)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1昆津病毒Kunjin virus ; KUNV
也可译为“库京病毒”,属于黄病毒科黄病毒属成员,于1960 年在澳大利亚的环喙库蚊(Culex an-nulirostris)中首次分离。除了环喙库蚊以外，伪杂鳞库蚊(Culex pseudovishnui)、 致倦库蚊(Culex
quinquefasciatus)、澳大利亚库蚊(Culex australicus)和鳞状库蚊(Culex suamosus)等也可传播该病
毒。病毒的主要宿主是鸟类、家禽、猪、牛、马。水鸟可以将病毒传播至远方,而猪、牛、马又可起到放大宿主的作用。昆津病毒病是一种人畜共患病,主要流行于澳大利亚,人类感染后主要表现为发热、头痛、肌肉痛,严重者可以发展为脑炎。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4613—2016
国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法Real-time RT-PCR method for Kunjin virus detection at frontier ports2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法SN/T46132016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
印张0.5字数10千字
开本880×12301/16
2018年1月第一版2018年1月第一次印刷印数1-500
书号：155066：2-32346
定价14.00元
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心本标准主要起草人：孙肖红、刘键、目冀焕、徐宝梁、马雪征、张丽萍、白红岩。SN/T4613—2016
1范围
国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法SN/T4613—2016
本标准规定了昆津病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理和荧光RTPCR检测。
本标准适用于昆津病毒的荧光RT-PCR检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发【200615号
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
昆津病毒Kunjinvirus;KUNv
也可译为“库京病毒”，属于黄病毒科黄病毒属成员，于1960年在澳大利亚的环喙库蚊（Culexannulirostris）中首次分离。除了环喙库蚊以外，伪杂鳞库蚊（Culerpseudouishnui），致倦库蚊（Culerquinquefasciatus）、澳大利亚库蚊（Culeraustralicus）和鳞状库蚊（Culersuamosus）等也可传播该病毒。病毒的主要宿主是鸟类、家窝、猪、牛、马。水鸟可以将病毒传播至远方，而猪、牛、马又可起到放大宿主的作用。昆津病毒病是一种人畜共患病，主要流行于澳大利亚，人类感染后主要表现为发热、头痛、肌肉痛，严重者可以发展为脑炎，4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR
5生物安全要求
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；FAM荧光染料，一种荧光报告基团；核糖核酸；
反转录-聚合酶链反应。
《人间传染的病原微生物名录》规定，昆津病毒的未经培养的感染性物质、灭活材料的操作应在不同级别生物安全实验室进行，具体如下：1
KAoNrKAca
SN/T4613—2016
昆津病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2或ABSL-2)实验室内进行；昆津病毒相关的灭活材料在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行昆津病毒感染性材料运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。6标本的采集、运输和保存
6.1人血清标本
无菌采集可疑病人的静脉血3ml~5mL，室温静置30min，然后500g离心10min，收集上清（血清）于2mL螺口塑料管内：用耐低温油性记号笔记土编号于—70℃或以下温度。
6.2蚊虫
根据实际工作需要采集蚊虫样品。将采集的蚊虫直接放人下送检，不能及时检测的标本应保存C冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只~50只一份，装入2mL螺口塑料管内用耐低温油性记号笔记上编号，干冰或液氮运输，或-70℃以下保存待检。
7标本的处理
7.1人血清标本
血清标本可直接提取核酸。
7.2蚊虫
7.2.1从-70℃容器中取出蚊虫标本，倒人研磨器中。7.2.2加人1mLPBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加人1mLPBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失。
7.2.3将研磨液吸人1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上.20000g离心10min。7.2.4取上清液提取核酸。
8荧光RT-PCR检测
8.1主要仪器
需要以下仪器：
荧光定量PCR仪；
超净工作台；
生物安全柜；
高压灭菌锅
低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器；
冰箱：4℃、-20℃和-70℃；
移液器10μL、20gμL、100μL200μL和1mL。2
TrKAONKAca
8.2主要试剂
SN/T4613-2016
核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸8.2.1
8.2.2荧光RT-PCR通用试剂：Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品\。8.2.3无RNA酶的DEPC水。
引物和探针：引物和探针序列见表1，8.2.4此内容来自标准下载网
表1昆津病毒荧光RT-PCR检测的引物和探针引物/探针名称
KUNV-F
KUNV-R
KUNV-P
8.3核酸提取
序列（52-37）
TGGAGAGTATGGAGAAGTAACAGTG
TCCTCCAAACATTACTTTCAGCAC
FAM-ACCACGCTCAGGGATAGACACCAGT-TAM按试剂盒操作说明书。
8.4加样
扩增片段（E基因）
预期扩增片段为
准备实时荧光RT-PCR反应液，设25uL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2XRTPCRBuffer12.5μL,10μmol/L,KUNV-F1μl,10μmol/LKUNV-R1μL,10μmol/LKUNV-P0.5μL25×RT-PCREnzymeMix1μL、模板RNA5μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板可为昆津病毒核酸，也可为根据病毒E基因核苷酸序列体外合成的RNA片段，阴性对照模板为不含昆津病毒核酸的标本或无RNA酶的DEPC水。8.5实时荧光RT-PCR扩增反应
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500HT荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：45℃25min，95℃10min；95℃15s，55℃60s（收集荧光信号），40个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求适当调整反应条件。
8.6结果分析
8.6.1阅值确定
阈值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阐值时所对应的循环数为循环值（CI值）。8.6.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct≤35并有明显扩增曲线。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品TIKAONT KAca
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8.6.3结果判定
根据以下条件进行结果判定：
无Ct值或Ct值38，且无明显扩增曲线，判断为昆津病毒荧光RT-PCR检测阴性。-Ct值≤35，并有明显扩增曲线，判断为昆津病毒荧光RT-PCR检测阳性。36≤Ct值38的标本必须重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为昆津病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。荧光RT-PCR结果阳性的标本可进一步进行RT-PCR扩增，对扩增片断测序和序列比对后，确认是否为昆津病毒核酸阳性。书号：155066·2-32346
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