SN/T 3306.7-2016.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 7 :Monkeypox virus.
1范围
SN/T 3306.7规定了国境口岸猴痘病毒环介导恒温扩增检测方法。
SN/T 3306.7适用于国境口岸出人境人员或动物携带猴痘病毒的筛选检测。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T 2097人 出境人员猴痘检验规程
WS/T 230临 床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.
Bst :嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus steurothermophilus)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( ethylenediamine tetraacetic acid)
LAMP:环介导恒温核酸扩增(loop mediated isothermal amplification)
Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[ tris( hydroxymethyl) aminomethane-HCI]
Triton X-100:聚乙二醇对异辛基苯基醚[Polyethylene Glycol Mono( p-1, 1, 3, 3-tetramethyl butyl) phenyl Ether]
4生物安全要求
所有有关猴痘病毒的实验室操作应按照以下规定执行:
一猴痘病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级(BSL-3或ABSL-3)实验室内进行;
一猴痘病毒 未经培养的感染材料的操作在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行;
一猴痘病毒灭 活材料的操作在生物安全二级(BSL-2)实验室内进;
一猴痘病毒相关的无感染性的材料操作在生物安全- -级(BSL-1)实验室内进行;

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.7—2016
国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP)检测方法第7部分：猴痘病毒
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part7:Monkeypoxvirus
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为7个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒。
本部分为SN/T3306的第7部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。SN/T3306.7—2016
本部分主要起草人：郑伟、吕沁风、吴忠华、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、沈若川、周健青、李禾、李洪波HiiKAoNni KAca
iiKAoNiKAca
1范围
SN/T3306.7--2016
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第7部分：猴痘病毒
SN/T3306的本部分规定了国境口岸猴痘病毒环介导恒温扩增检测方法。本部分适用于国境口岸出人境人员或动物携带猴痘病毒的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2097人出境人员痘检验规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bst：嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillussteurothermophilus）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleieacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid)LAMP：环介导恒温核酸扩增（loopmediatedisothermalamplification）Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris(hydroxymethyl)aminomethane-HC]TritonX-1oo：聚乙二醇对异辛基苯基醚[PolyethyleneGlycolMono（p-1,1，3，3-tetramethylbutyl)phenylEtherj
4生物安全要求
所有有关猴痘病毒的实验室操作应按照以下规定执行：猴痘病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3)实验室内进行；猴痘病毒未经培养的感染材料的操作在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行：猴痘病毒灭活材料的操作在生物安全二级（BSL-2)实验室内进；猴痘病毒相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行；猴痘病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。5对象
疑似感染猴痘病毒的出人境人员。5.2
疑似携带猴痘病毒的出人境动物。1
TiiKAoNniKAca
SN/T3306.7—2016
6技术概要
根据猴痘病毒基因保守序列设计两对内、外引物，识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg?+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，离心即可通过白色沉淀是否产生观察判定结果7试剂
在实验过程中需要以下试剂：
引物：位于猴痘病毒基因组48332bp～48780bp（参见附录A），组成如下：·外引物1(F3）：5*-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3；外引物2（B3）：5\-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3\内引物1（FIP）：5'-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT3\
·内引物2(BIP)：5-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3';
·环引物（LP）：5-CGTTCTGACACAGAGATTGTGTG-3。BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL；dNTPs：dATP.dGTP.dTTP、dCTP各1ommol/L：DNA提取试剂盒
Tris-HCl.500mmol/L;
MgSO.:8mmol/L;
甜菜碱：8mmol/L，
(NH.),SO.:100mmol/L:
KCl:500mmol/L;
Tritonx-100.10%。
8仪器设备
在实验过程中需要以下仪器设备：移液器：量程0.1μL~2.5μL、量程1μL～10μL、量程10μL～100pL量程100μL～1000μL；普通台式离心机；
高速台式离心机：≥10000g：
水浴锅或加热模块；
一70℃超低温冰箱；
计时器。
9检测程序
猴痘病毒LAMP检测程序见图1。
iiKAoNiKAca
操作步骤
10.1标本的采集与保存
特测标本
病毒核酸提取
LAMP反应
确认实验
传统方法复核
猴痘病毒LAMP检测程序
SN/T3306.7—2016
10.1.1全血采集：采集疑似病人或疑似携带动物的抗凝全血5mL，2℃～8℃运输保存，长期保存需离心500g10min分离血浆冷冻于-70℃冰箱。10.1.2水疱液和脓疱液采集：采用一次性注射器吸取0.2mL无菌生理盐水，从疱膜中注人，来回吸取2次～3次，吸取内溶液，装留样管中，2℃～8℃运输保存，长期保存需冷冻于-70℃冰箱。10.1.3皮疹、皮痴采集：取皮疹上盖或者皮痴，装人留样管中，密封2℃～8℃运输保存，长期保存需冷冻于-70℃冰箱。
10.2核酸提取
核酸提取按SN/T2097操作，也可使用等效市售DNA提取试剂盒。10.3LAMP检测
反应体系
待测标本的反应体系见表1.也可使用市售等效猴痘病毒LAMP试剂盒。3
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SN/T3306.7—2016
引物F3
引物B3
引物FIP
引物BIPwww.bzxz.net
引物LP
BstDNA聚合酶
甜菜碱
Tris-HCl
(NH.),SO.
Triton X-100
模板/空白对照/阴性
对照/阳性对照
猴痘病毒LAMP反应体系
工作液浓度
10μmol/L
10μmol/L
50μmol-L
50μmol L
50μmol/L
8mmolL
10mmolL
500mmol.L
500mmolL
100mmol L
100mmol-L
加样量
反应体系终浓度
0.04μmol/L
0.04μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
0.32U/μL
0.8mmol/L
0.8mmol/L
20mmol/L
10mmol/L
8mmol/L
6.8mmol/L
模板根据提取的浓度可酌情加1pL～5p，其他对照加样量为5μL补足至25μl
空白对照、阴性对照和阳性对照的设置每次实验均应设空白对照、阴性对照和阳性对照：空白对照：以灭菌双蒸水替代DNA模板：阴性对照：以DNA提取液替代DNA模板；阳性对照：含靶序列的核酸作为DNA模板。10.3.3
反应过程
按表1配制反应体系，在对应编号的反应管中加人制备的核酸提取液，盖紧管盖，瞬时离心10s。防污染方法和措施按WS/T230操作。263℃扩增60min。
结果观察
离心1200g，3min，观察白色沉淀产生。10.5
结果判定和报告
LAMP反应的质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件，否则试验结果无效，应更换试剂重新检测：空白对照和阴性对照反应管离心后未见白色沉淀；阳性对照反应管离心后可见白色沉淀。4
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10.5.2LAMP反应的结果判断和报告SN/T3306.7—2016
10.5.2.1阳性：待检标本反应管离心后可见白色沉淀，报告为猴痘病毒LAMP检测阳性。阴性：待检标本反应管离心后未见白色沉淀，报告为猴痘病毒LAMP检测阴性，10.5.2.2
10.5.2.3LAMP检测阳性，说明从该待测标本中检测到目的基因片段，提示可能有猴痘病毒存在，如需确认应对该样品做进一步的分离或测序鉴定。HiiKAoNniKAca
SN/T3306.7—2016
（资料性附录）
猴痘病毒靶基因序列
猴痘病毒基因序列(Accessionno：HQ857563.1，位置：48332bp4878obp）：4830l tcattgattt ttcgcgggat acatcatcta ttatagcatc agcatcagaa tctgtaggcc4836l gtgtatcagc atccattgtc gtagaccaac gaggaggagt atcgtcggaa ctgtacacca48421 tagtactacg ttgaagatca tacagagctt tattaacttc tcgcttctcc atattaagtt4848l gtttagttag ttgtgcagta gctccttagt ccaatgtttt taataaccgc acacaatctc48541 tgtgtcagaa cgctcgtcaa tatagatcgt agaaattttt tagagagaac taacacaact4860l agcaataaaa ctgatcttat tttatcattt tttattcat catcctctgg tggttcgtcg4866l ttcctatcga atgtagctct gattaacccg tcatctatag gtgatgctgg ttctggagat48721 tctggaggag atggattatt atccggaaga atctctgtta tttccttgtt ttcatgtatc6
SN/T3306.7-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第7部分：猴痘病毒
SN/T3306.7—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.75字数14千字
2017年1月第一版2017年1月第一次印刷印数1-1100
书号：1550662-31099
定价16.00元
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