SN/T 4525.2-2016.Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 2:Sta phylococcus aureus.
1范围
SN/T 4525.2规定了出口食品中金黄色葡萄球菌分子分型MLST检测方法。
SN/T 4525.2适用于出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄 色葡萄球菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403实验室质量控制规范 食品 分子生物学检测
3术语和定义 、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因
3.1.2
Taq DNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase
从Thermus aqrualius 细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy- ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)
ST:序列型(Sequence Type)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris( hydroxymethyl)aminomethane]

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.2—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MILST方法第2部分：金黄色葡萄球菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 2:Staphylococcus aureus2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SV/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌：
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第2部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4525.2—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扭识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本部分主要起草入：邵景东、申进玲、吴福平、王毅谦、郭旸、薛峰、王新、蒋原、石晶1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第2部分·金黄色葡萄球菌SN/T4525.2--2016
SN/T4525的本部分规定了出口食品中金黄色葡葡球菌分子分型MI.ST检测方法。本部分适用于出口食品中金黄色者2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.10食品安全国家标准
食品微生物学检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489
实验室生物安全通用要求
金黄色葡萄球菌检验
GB/T27403
实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因housc-keepinggenes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因3.1.2
Taq DNA酶Thermusaquaticus DNA polymerase从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dVTP，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetra&ceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：二（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)atninomethane]4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核皆酸序列，对其组合进行索引编1
SN/T4525.2—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DVA酶污染的容器分装。5.1DNA提取液:50mmol/1.Tris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl,1%SDS.
5.2酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）。5.3异丙醇。
5.475%乙醇。
TE溶液（pH8.0)：10mmol/L.Tris-HCI(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)，高压灭菌。TaqDNA酶。
dNTP:dATP、TTP.dCTP.dGTP
引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.10
2%琼脂糖凝胶。
EB核酸染色剂。
分子量标记：100bp~2o00bpDNAmarker5×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸.10mmol/LEDTA（pH8.0），使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213或等效菌株。5.14
6仪器和设备
6.1离心机。
2天平：量程2kg，感量0.1g。
3pH计。
涡旋振荡器。
6.5PCR仪。
5电泳仪。
6.7凝胶成像仪。
基因测序仪。
9超净工作台。
移液器:0.1μL~2.5μL2μL~20μL20uL~200μL、100μL~1000μL7操作流程
MIL.ST的操作流程见图1。
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组 DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
MLST操作程序
SN/T4525.2--2016
将经过GB4789.10的方法鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株制备模板提取基因组DNA。取待测样本1mL，加到1.5mL离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清，加人750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500uL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500μL上清液与400μL的异内醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，弃去上清，沉淀干煤后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于一20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
取5uLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A2s和A280DNA的浓度按式（1)计算：C-AXNX50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（ug/μL）；A
-260nm处的吸光值；
（1）
SN/T4525.2—2016
N核酸稀释倍数
当A26u/A28比值在1.7~1.9之间时.适宜于PCR扩增。8.3MLST基因选择
按表A,1所示，选择金黄色萄球菌的7个管家基因进行MI.ST分析。8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A2中的序列，合成金黄色葡葡球菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物（测序引物）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10mol/L，一20℃保存备用。8.5目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50uL：10×
PCR缓冲液5μl.dNTPC10md
01/L）2μL、引物对（10μmol/1）2μL、TaqDNA聚合酶（5U/uL）5.4u、模板DNA5μL、水33.6反应条件为：94℃5min94℃1min.55℃1min.72℃30sec.35个循环；72℃7min。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光不成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定
8.6DNA序列测定
将PCR产物纯化后，采用表41.2中的测序引物对管家基因的DNA序列进行双向测序。8.7结果报告
将所得到的金黄色葡萄球菌
个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然后使用Lasergene7.1对行ClustalV分析将1下游序列整合后得到完整序列，为减序列进
最后将测序结果上传至MLST网站（http：//小误差首尾的几个碱基不计算入定结果
到的结
mist.net)进行在线数据分析，得与MLST数据库进行比对
在确定序列型的基础上应用（
BURST或其他软件将菌株分为各个谱系组，构建系统遗传进化树（参见附录B)。9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测金黄色葡萄球菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定，基因名称
附录A
（规范性附录）
金黄色葡萄球菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
MLST基因位置
2727069-2727524
1607719-1608174
232897
1232433-1
11269231
577169-577649
779958-780359
347923-348438
引物名称
are up(Forward)
are dn(Reverse)
aroup(Forward)
aro dn(Reverse)
glp up(Forward)
gip dn(Reverse)
gmk up(Forward)
gmk dn(Reverse)
pta up(Forward)
pta dn(Reverse)
ipi up(Forwerd)
tpi dn(Reverse)
yqi up(Forward)
ygi dn(Reverse)
金黄色葡萄球菌管家基因
管家基因名称
氨基甲酸激酶基因（Cerbematekinase）SN/T4525.2--2016
华直聚脱气酶基因（Shikim
atedehydrogenase)
甘泊激酶基因（Glvceroukinase）鸟干酸激蒂基因（Guanylat
磷酸乙聘转移梅基国（Phe
kinase)
phateacetyltranserase)
磷酸丙糖异构醇基因（Triosephosphateisomerase)）Z辅酶A乙酰转移酶基因（AcetyleconenzymeAacetyltrans-ferase)
金黄色葡萄球菌管家基因的扩增（测序）引物序列
TGATTObzxZ.net
ACCAGCGCGTATTGTC
CTT CAA TCA GCG
AGG TAT UTG
ATCGGA AAT COTATT TCACAT TC
GGTGTTGTATT
ATA ACGATA TC
ATCTTAATCC
GGAACTGC
TAAAATGGG
ATGTCC AATTC
ATCGTT
TTTATCGGGACCATC
ACGTAATCG TA
GTTAAAATCGTA
ATTA CCT GAA GG
GACCCTTTT GT
TT GAAAAG CTT AA
TCGITCATT
TGAAC GTCGTG AA
TTT GCA CT TCT AAC AAT TGT ACCAG CAT ACA GGA CAC CTA TTG GCCGT TGA GGA ATC GAT ACT GGAACSN/T4525.2—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的金黄色葡萄球菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定金黄色葡萄球菌分离株的序列型（ST)。在确定ST的基础上应用eBURST程序或其他相关软件将菌株分析，构建系统遗传进化树。图B.1为一些金黄色葡萄球菌进行MLST分析后，绘制的系统遗传进化树图。42.86
42.8639.56
部分金黄色葡萄球菌系统遗传进化树图中
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