SN/T 4525.6-2016.Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 6:Stre ptococcus pyogenes.
1范围
SN/T 4525.6规定了检测出口食品中化脓链球菌的分子分型MLST法。
SN/T 4525.6适用于出口食品中化脓链球菌的分子分型检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB4789.11食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
GB/T 27403实验室质量控制规范 食 品分子生物学检测
3定义、术语和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的一类基因。其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因
3.1.2Taq DNA酶
Thermus aquaticus DNA polymerase
从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2缩 略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy- ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)
ST:序列型( Sequence Type)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris( hydroxymethyl) aminomethane]

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.6--2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第6部分：化脓链球菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 6:Streptococcus pyogenes2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第6部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T4525.6--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本部分主要起草人：蒋鲁岩、王毅谦、袁芳、封振、薛峰、肖震、倪鹏、邵景东、曾德新。1
1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第6部分：化脓链球菌
SN/T4525.6--2016
SN/T4525的本部分规定了检测出口食品中化脓链球菌的分子分型MLST汰。本部分适用于出口食品中化脓链球菌的分子分型检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版木（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.11食品安全国家标准食品微生物学检验B型溶血性链球菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3定义、术语和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因
house-keeping gene
所有细胞中均要表达的一类基因其产物是对维持细胞包基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因3.1.2
每Thermus aquaticus DNA polymeraseTaqDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDianineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocus sequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane]SN/T4525.6—2016
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装，5.1DNA提取液:50mmol/LTris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl,1%SDS
酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）。5.2
3异丙醇。
75%乙醇。
5TE溶液（pH8.0)：10mmol/LTris-HCI(pH8.0)，lmmol/L.EDTA(pH8.0)，高压灭菌。5.5
Taq DNA酶
dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L.氯化镁。5.10
2%琼脂糖凝胶。
EB核酸染色剂。
分子量标记：100bp~20c0bpDNAmarker。5XTBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）。使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
5.14质控菌株：化脓链球菌StreptococcuspyogenesM1GAS或等效菌株。6仪器和设备
离心机。
2天平：量程2kg，感量0.1g。
pH计。
涡旋振荡器。
5PCR仪
6.6电泳仪。
6.7凝胶成像仪。
基因测序仪。
超净工作台。
移液器:0.1μL~2.5μL、2μL~20μl.、20μl~200μl、100μl~1000uL。7操作流程
多位点序列分子分型操作流程见图12
8操作步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
多位点序列分型(MLST)操作步骤SN/T4525.6--2016
将经过GB4789.11的方法进行鉴定为化脓链球菌的菌株提取基因组DNA。取待测样本1mL,加到1.5mL离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清。加人750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混勺，13000r/min离心5min，吸取500uL上清液与400L的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，弃去上清，沉淀干燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和A23：DNA的浓度按式（1)计算：C=AXNX50/1000
式中：
-DNA浓度，单位为微克每微升（g/uL），A
260nm处的吸光值：
SN/T4525.6—2016
N核酸稀释倍数
当A25/A28比值在1.7~-1.9之间时，适宜于PCR扩增8.3MLST基因选择
按表A.1所示，选择化脓链球菌的7个管家基因进行MLST分析。8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A.2中的序列：合成化脓链球菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物，弓物在使用前按照相应分子量进行稀释到10umol/L，一20℃保存备用。8.5目的基因片段的PCR扩增
PCR缓冲液5L.dNTP(lomm
ol/1)2μL、引物对（10μmol/L)反应体系体积为50μL：10×1
2μl、TaqDNA聚合酶（5U/uL）4L模板DNA5L水33.6A反应条件为：95℃5min95℃1min，55℃1min.72℃
30s.35个循环：72℃7min。
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
6DNA序列测定
采用表A.2中的测序引物用基因测序仪对管家基因的DNA序列进行双向测序。也可请有同等能力的检测公司测序。
8.7结果报告
测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然将所得到的化脓链球菌7个管
家基因
后使用Lasergene7.1对序列进行Clustal的几个碱基不计算人序列测定结果
1分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾所将测序结果
在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对软件将菌株分为各个谱系组，构建系统9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
传至ML.ST网站（http：//mlst.net）进行在确定序列型的基础上应用e-BURST或其他遗传进化树（参见附录
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测化脓链球菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。
9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。基因
附录A
（规范性附录）
化链球菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
MLST基因位置
1258289-1258786
1236746-1237195
312730313
1787594 1787998
1391380-1391838
930970-931419
129469-12999
化脓链球菌管家基因
管家基因名称
SN/T4525.6—2016
葡糖激酶（Glucosekinase)）
taminetransporterprotein)
谷氨酰胺转运蛋G
Glutamate racemase)
谷氨酸消旋酶
DNA错配修复蛋白（DNAmismatchrepairprotein）酮醇酶（Transketolase)
黄嘌岭磷酸核糖转移酶（Xanthinephosphoribosyltransferase）乙酰酶A乙酰转移酶（Acetyl-CoAaceryltransferase)）该位置是基于化脓性链球菌M1GA5全基因组序列而定：该菌株基因组全长1852433bp。表A.2
引物名称
gki-up
gki dn
gtr-dn
murl-up
murl-dn
murS-up
murs-dn
reeP-up
reeP-dn
xpr-dn
yqil-up
基因的技
化脓链球菌管家：
ATGGGATCACC
ITGGAAWww.bzxZ.net
GAGGTTG
GCTGACAC
列和测序引物序列
TGGTGATTATT
CCCATTTCATG
GGAAAGO
AATGTT
TAATGTCAAAATAG
GATGATAATTCACCGT
GAAGAGTCATCTAGTTTAGAATACG
AGAGAGTTGTGACTTGCGCGTTTGATTGCTGCAAATTCTGGACACCCAGG
CTTTCACAAGGATATGTTGCC
TTACTTGAAGAACGCATCTTA
ATGAGGTCACTTCAATGCCC
TGCAACAGTATGGACTGACCAGAGAACAAGATGOCAAGGTCTCGTGAAACCGCTAAAGCCTGAGSN/T4525.6—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的化脓链球菌7个管家基因核酸扩增片段DXA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定化脓链球菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用e-BURST程序或其他软件将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为部分化脓链球菌进行ML.sT分析后，绘制的系统遗传进化树图
ATCC12344
的关导的的腺的其试过尿据
1.4010.71
TQCC22107
2让：
14：29
部分化脓链球菌系统遗传进化树图图B.1
ATcC13285
fQcc22110
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