SN/T 4525.10-2016.Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 10 :Yersinia enterocolitica.
1范围
SN/T 4525.10规定了出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型MLST检测方法。
SN/T 4525.10适用于出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.8--2008食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
GB/T 27403实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house -keeping genes
所有细胞中均要表达的一类基因其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因。
3.1.2
Taq DNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase
从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP :脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy- ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.10—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 10.Yersinia enterocolitica2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第10部分。MI.ST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4525.10--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：陈颖、王娉、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美。1
1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌SN/T4525.10--2016
SN/T4525的本部分规定了山口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型MLST检测方法。本部分适用丁出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用工本文件。GB/T4789.8—2008食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要
GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本义件
国house-keepinggenes
管家基因
所有细胞中均要表达的一类基因其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因3.1.2
Taq DNA酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermusαguaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件，
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonuclcosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocusscqucncetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)arninomethaneSN/T 4525.10—2016
4原理
ML.ST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之问取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1ETagDNA聚合酶。
5.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。5.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒。5.410XExTaqBuffer(20mmol/LMgCl,)。5.5琼脂糖。
5.6TAE缓冲液.2mol/LTris-HCl(pH8.4),1mol/L乙酸，100mol/LEDTA5.7参考菌株：小肠结肠炎耶尔森氏菌.enterocolitica8081（NCTC13174）。6
仪器和设备
PCR扩增仪。
6.2离心机。
6.3核酸蛋白分析仪
6.4电泳仪。
6.5分了凝胶成像仪。
微量移液器和灭菌吸头：10ul.100μl、200，1000μ。恒温培养箱。
恒温水浴锅：
6.9犬平。
灭菌三角烧瓶：500mL、250mL。灭菌平皿：90mm×15mm
灭菌试管：内径3mm，长5cm。
7检测程序
对小肠结肠炎耶尔森氏菌7对管家基因分别设计引物，并进行PCR扩增（引物序列见表A2），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的小肠结肠炎耶尔森氏菌了对管家基因测序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.net）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定小肠结肠炎耶尔森氏菌分离株的序列型（SequenceTypc，ST），并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用MEGA程序对菌株进行聚类分析（参见附录B）。2
MLST的操作程序见图1。
8检测步骤
提取细菌基因组DNA
提取细菌基因组DNA
MLST基因选挥
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
MLST操作程序
SN/T4525.10--2016
将经过GB/T4789.8一2008的方法鉴定为小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌株提取基因组DNA。8.2MLST基因选择
选择耶尔森氏菌属的7个管家基因作为日的基因进行MLST分析，如表A.1所示，它们分别是蛋白UbiB合成酶基因（putativeubiquinonebiosynthesisproteinUbiB，aarF）、双官能磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶/磷酸泛酸合成酶基因（bifunctionalphosphopantothenoylcysteinedecarboxylase/phosphopanto-thenatesynthase，dfp）、DNA结合的转录调节基因（DNA-bindingtranscriptionalregulator，galR）、谷氨酰-tRNA合成酶基因（glutaminyl-tRNAsynthetase，glnS）、谷氨酰-tRNA还原酶基因（glutamyliRNAreductase，hemA）、双官能庚糖-7-磷酸激酶/庚糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因（bifunctionalhcptosc7-phosphatekinase/heptose1-phosphateadenyltransferase，rfaE），精氨酸脱羧酶基因（argininedecar-boxylase,speA)
8.3PCR引物和测序引物的选择
针对表A.1中小肠结肠炎耶尔森氏菌7个目的基因，合成7对相应的PCR引物序列（表A.2）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，一20℃保存备用。3
SN/T4525.10—2016
8.4目的基因片段的PCR扩增
采用50μlPCR反应体系：10×PCRbuffer5μl，dNTPMixlure4μL，l：、下游引物（10μmol/L）各1L，Tag合酶（5U/μL)0.5μLDNA模板2μl，去离子水补齐至50μL。扩增程序为：
galR、glnS和hemA基因的反应条件为：94℃5min；94℃30s,54℃30s.7230s.35个循环72℃5min。
dfp和rfaE*基因的反应条件为：94℃5min：94℃30s,58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min
speA基因的反应条件为：94
2℃30s.35个循环，72℃5min，
aarF基因的反应条件为：[email protected]℃30s.72C30s.35个循环；72℃5min。
rfaE基因的反应条件为：945min：94℃30s.57~30s.72C305，35个循环：72℃5min。
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电
物进行DNA序列测定。
8.5DNA序列测定
后紫外光下成像观察，条带单：且明亮的PCR产PCR产物的纯化后对目的基因的DNA序列行双向测序，对王所有基因序列对上下游进行2次双向序列测定，
8.6结果报告
将所得到的小肠结肠炎耶尔森氏菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行ClustalV分析·将上下游序列整合后得到完整序列，为减小比对，然后使用Lasergene7.1对序列进行误差首尾的儿个碱基不计算人序列测定结果。
最后将测序结果上传至MIL.ST网站（http：//mlst.war-wick.ac.uk/mlst/)进行在线数据分析，得到的结果与MLsT数据库进行比对。9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全应由具备资格的工作人员检测小易结肠炎耶尔森氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
基因名称
附录A
（规范性附录）
SN/T4525.10—2016
小肠结肠炎耶尔森氏菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
小肠结肠炎耶尔森氏菌管家基因基因表达产物
putativeubiguinone biosynthesis protein UbiRBfunctonalplosohouantethenovlevsteinedecarboxvlDNA-binding transcripuional
nv-IRNAsynt
tamvl-tRN
bifunctional
基因名称
tose/-pho
phosphopantothenate synthasegulator
ictase
ccarboxylase
Kinase/hcptose l-phosphate adenyltransferase小肠结肠炎耶尔森氏菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列
引物序列（5°-3%）
TTCCATGCAGATATGCATCO
CCACTGACTAATAGTGTAGC
CATAACGGC
GACAATCTCG
GATCCAGTG
CGCTTTATCAC
ATTGGAAAO
GTTGGGCTGAACATATTGGI
GCACAG
AATAACCTT
GAATCCTG
CGGTTAGCAATAATCATATG
ATGACTCTGCTTGCATTAGG
CAGATAAACCTTATGGCCC
ATGTCTGATGATAACTTGATT
ATCGCTGCCTTTGGGATC
ATGAAAGTCACGCTGCCTGA免费标准bzxz.net
PCR产物长度
Alternate rfaE primers specific for Y.enterocolitica serotype O:3GGATAGATTTGGTGTCAGTAGC
ATGAAAGTCACGCTGCCTGA
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附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的小肠结肠炎耶尔森氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定小肠结肠炎耶尔森氏菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为部分小肠结肠炎耶尔森氏菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图，100
100|10.906
部分小肠结肠炎耶尔森氏菌系统遗传进化树图10.907
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