SN/T 4525.8-2016.Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 8: Enterovirulent Escherichia coli.
1范围
SN/T 4525.8规定了出口食品中致泻性大肠埃希氏菌的分子分型MLST法。
SN/T 4525.8适用于出口食品中致泻性大肠埃希氏菌的分子分型检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单;适用于本文件。
GB/T 4789.36食品 卫生微生物学检验大 肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
GB/T 27403实验室 质量控制规范食品分 子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的-类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因
3.1.2
TaqDNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase
从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)
ST:序列型(Sequence Type)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[ tris( hydroxymethyl)aminomethane]

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.8—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 8:Enterovirulent Escherichia coli2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌：
第3部分：副溶血性弧菌：
第4部分：霍乱弧菌：
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第8部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4525.8—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：赵宏、李宗梦、赵良娟、蔡国瑞、郑文杰、薛峰1
1范围
SN/T4525.8—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中致泻性大肠埃希氏菌的分子分型MLST法。本部分适用于出口食品中致泻性大肠埃希氏菌的分子分型检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T4789.36食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因
house-keepinggenes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保达，义称看家基因，持家基因
守并且在大多数情况下持续表达3.1.2
Thermus aquaticus DNA polymeraseTagDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST:序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1
-KAoNiKAca
SN/T4525.8—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得厂平衡，且结果准确.所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1商品化的细菌基因组提取试剂盒。2TaqDNA酶。
5.3dNTPdATP、dTTP,dCTP、dGTP)溶液：各2.5mmol/L引物：扩增引物和测序引物序列见表A.1。5.4
510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4）.200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁5.5
琼脂糖。
溴化乙锭（EB）：10mg/ml.。
36×漠酚蓝上样缓冲液
分子量标记
5.105XTBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0)。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。5.11质控菌株：EscherichiacoliO157：H7（ATCC35150）或等效菌株。5.12培养基：所需试剂见GB/T4789.36。6设备
6.1离心机。
天平：量程2kg，感量0.1g。
6.3pH计。
涡旋振荡器：
5PCR仪。
5电泳仪。
凝胶成像仪。
基因测序仪。
6.9超净工作台
移液器：0.1μL~2.5μL2μL~20μl20μL~200μl100μl~1000μl操作流程
多位点序列分子分型操作流程见图1。-rKAoNiiKAca
8操作步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据分析
多位点序列分型（MLST)操作步骤SN/T4525.8—2016
将经过GB/T4789.36的方法鉴定为致泻性大肠埃希氏菌的菌株提取基因组DNA。取待测样本1mL，加到1.5mL离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清。加入750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚：三氯中烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500l上清液与400uL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000/min离心5min，弃去上清，沉淀T燥后溶于30μuLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于一20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A5和Az3。DNA的浓度按式（1)计算：C=AXNX50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（ug/μL）；.（1）
-TTKAONiKAca
SN/T4525.8—2016
A260nm处的吸光值；
N——核酸稀释倍数，
当A26/A28n比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增8.3MLST基因选择
选择大肠埃希氏菌的7个管家苯因作为目的基因进行MLST分析，如表A.2所示。8.4PCR引物和测序引物的选择
针对致泻性大肠埃希氏菌7个管家基因序列（参见B1）：合成7对相应的PCR引物序列和7对测序引物序列（表A.1）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10μm01/L，一20℃保存备用。8.5管家基因片段的PCR扩增
采用50μLPCR反应体系。反应条件为94℃，5min94℃1min，53℃2min，72℃3min，30个循环；72℃10min。
将PCR产物进行1.5%琼脂糖胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定
8.6PCR产物的纯化和DNA序列测定序列进行双向测序，
采用表A.1中的测序引物对管家基因的DNA8.7结果报告
将所得到的致泻性大肠埃
7个管家基因测序结果与（GenBank中的已有的相关基因进行希氏菌
V分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减BLAST，然后使用Lasergene71对序列进行ClustalwwW.bzxz.Net
小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果
最后将测序结果传至MLST网站（http：//wwwshigatox.net/ecmlst）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。将所得到的致泻性大肠埃希氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定致泻性大肠埃希氏菌分离株的序列型（SequenceType,ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplcx），构建系统遗传进化树，参见B.2。
9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致泻性大肠埃希氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
-rKAoNiKAca
附录A
（规范性附录）
致泻性大肠埃希氏菌用于MLST分析的管家基因及扩增引物表A.1
aspc-F4
aspC-R7
clpX-F6
elpX-R1
fadDF6
fadD-R3
icd-F2
icd-R2
lysP-F1
lysP-R8
SN/T 4525.8—2016
致泻性大肠埃希氏菌用于MLST的7个管家基因扩增及测序引物引物序列
5'-GTTTCG TGCEGATGAAOGTC-3
5'-AAACCCTGGTAAGCGAAGTC-3
5'CTGGCGGTCGCGGTATACAA-3
5'GACAACCGGCAGACC
5'-GCT GCC GCT GTA
ACCAA-S'
TCA CATTT
5'-GCG CAG GAA TCO TTC
5'-CTGCGCCAGGAA CT
TCAT-3'
5'-ACC GTG GGT GGCTTCAAA CA-35'-CTTACGCCGTGAATTAAAGG3
5' GGT TCC CTG GAA AGA GAAGC-35'-GTCGATCTG
5'-TACTO
uidA-277F
uidA-934R
基因名称
AICCCTAC-S
AGCCAT
TCGCCTTCAAC-3
5'-CATTAC GGCAAAGTG
TGOGTCAAT3
5'-CCA TCA GOA C
CGTTAT CGAATCCTT
基因中的位置
1328..1347
001..1020
表A.2致泻性大肠埃希氏菌的管家基因基因长度
基医功能
扩增长度
门冬氨酸氨基转移酶（aspertateaminotransferase）酪蛋白裂解酶X基因（ATPaseand speeificitysubunitofClpX-ClpPATP-dependent serine protease)乙酰辅酶A合成酶（acyl-CoAsynthetase）异丙基苹果酸脱氢酶（isocitrate/isopropylmalatedehydrogenase）赖氨酸转运酶基因（lysinetransporter）苹果酸脱氢酶基因（malatedehydrogenase）9-简糖苷酸酶基因（beta-D-glucuronidase）5
-KAONKAca
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附录B
（资料性附录）
管家基因序列及进化树的构建
致泻性大肠埃希氏菌管家基因序列B.1
aspc基因：
attggtgtctataaagatgagacgggcaaaaccccggtactgaccagcgtgaaaaaggctgaacagtatctgctcgaaaatgaaaccaccaaaaattacctcggcaltgacggcatecctgaatttggtcgctgcactcaggaactgctgtttggtaaaggtagcgccctgatcaatgacaaacgtgctcgcacggcacagactccgggtggcactggcgcactacgcatagctgccgatttcctggcaaaaaataccagcgttaagcgagtggggtgagcaacccaagctggccgaaccataagagcgtctttaactctgcagatctggaagttcgtgaatacgcttattatgatgcggaaaaccacacccttgacttcgatgcactgattaacagcclgaacgaagctcaggctggcgacgtagtgctgttccatggctgctgccacaacccaaccggtatcgaccctacgctggaacaatggcagacactggcacaactctccgttgag
clpX基因：
gagttgggcaaaagtaacaltcigctgatcggtccgaccggttccggtaaaacgctgctggctgaaacgctggcgcgcctgctggacgtcccgttcaccatggccgacgcaaccacgctgaccgaagccggttatgtgggcgaagacgttgaaaacatcattcagaagctgttgcaaaagtgcgallacgacgtacagaaagcgcagcgcgggattgtctacatcgalgaaalcgacaagatttctcgtaagtcagacaacccgtctattacccgtgacgtttccggtgaaggcgtacagcaggcactgttgaaactgatcgaaggtacggtagctgctgttccaccgcaaggtggacgtaaacatccgcagcaggaattcttgcaggttgatacctctaagatcctgtttatttgtggcggtgcgtttgccggtctggataaagtgalltcccatcgtgtagaaaccggctecggcattggttftggcgcgacggtaaaagcgaagtccgacaaagcaagcgaaggcgagcigciggcgcaggttgaaccggaagatctgatcaagfadD基因：
tttatcgaactgggtgggcagaacctgcttatcactaacccgcgcgatattccagggltggtaaaagagttagcgaaatatccgtttaccgctatcacgggcgttaacaccttgttcaatgcgttgctgaacaataaagagttrcagcagctggatttctccagtctgcatctttccgcaggcggtgggatgccagtgcagcaagtggtggcagagcgttgggtgaaactgaccggacagtatctgctggaaggctatggccttaccgagtgtgcgccgctggtcagcgttaacccatatgatattgattatcatagtggtagcatcggtttgccggtgccgtcgacggaagccaaactggtggalgatgatgataatgaagtaccaccaggtcaaccgggtgagctttgtgtcaaaggaccgcaggigatgctgggttactggcagcgtcccgatgctaccgatgaaatcatcaaaaatggcicdA基因：
ggcactccaagcccggttaaacaccctgaactgaccgatatggltatcttccgtgaaaactcggaagacatltalgcgggtatcgaatggaaagcagaclctgccgecgccgagaaagtgattaaattcctgcgtgaagagatgggggtgaagaaaattcgcttcccggaacattgtggtatcggtattaagccgtgttcggaagaaggcaccaaacgtctggttcgtgcagcgatcgaatacgcaattgctaacgatcgtgactctgtgactctggigcacaaaggcaacalcatgaagttcaccgaaggagcgtttaaagactggggctaccagctggcgcgtgaagagtttggcggtgaactgatcgacggtggcccgtggctgaaagttaaaaacccgaacactggcaaagagatcgtcattaaagacgtgaltgctgatgcattcctgcaacagatcctgctgcgtccggctgaatatgatgttatcgcctgtatgaacctgaacggtgactacatttctgacgccctggcagcgcaggttggcggtatcggtatcgcccctlysP基因：
caggcaggtccgggcggggcattgctctcgtatatgctgattggcctgatggtttacttcctgatgaccagtctcggtgaactggctgcatatatgccggtttccggttcgtltgccacttacggtcagaactatgttgaagaaggctttggcttcgcgctgggctggaactactggtacaactgggcggtgactatcgccgttgacctggttgcagctcagctggtcatgagctggtggttcccggalacaccgggctggalctggagigcgttgttcctcggcgttatcttcctgctgaactacaletcagttcgtggctttggtgaagcggaatactggttctcactgatcaaagtcacgacagttattgtctttatcatcgttggcgtgctgatgattatcggtatcttcaaaggcgcgcagcctgcgggctggagcaaciggacaatcggcgaagcgccglligctggtggt6
iKAoNiKca
mdh基因：
SN/T4525.8-2016
ggtgaagatgcgactccggcgctggaaggcgcagatgtcgttcttatctctgcaggcgtagcgcgtaaaccgggtatggatcgttccgacctgtttaacgttaacgccggcatcgtgaaaaacctggtacagcaagttgcgaaaacctgcccgaaagcgtgcattggtattatcactaacccggttaacaccacagttgcaattgctgctgaagtgctgaaaaaagccggtgtttatgacaaaaacaaactgttcggcgttaccacgctggatatcattcgttccaacacctttgttgcggaactgaaaggcaaacagccaggcgaagttgaagtgccggttattggcggtcactctggtgttaccaltctgccgcigctgtcacaggttcctggcgttagttttaccgagcaggaagtggctgatctgaccaaacgcatccagaacgcgggtactgaagtggttgaagcgaaggccggtggcgggtctgcaaccctgtctatgggccaggcagctgcacgttttggtctgtctctggttcgtgcactguidA基因：
gagcatcagggcggctatacgccatttgaagccgatgtcacgccgtatgttattgccgggaaaagtgtacgtatcaccgtttgtgtgaacaacgaactgaactggcagactatcccgccgggaatggtgattaccgacgaaaacggcaagaaaaagcagtcttacttccatgatttctitaactatgccgggatccatcgcagcgtaatgctctacaccacgccgaacacctgggtggacgatatcaccgtggtgacgcatgtcgcgcaagactgtaaccacgcgtctgttgactggcaggtggtggccaatggtgatgtcagcgttgaactgcgtgatgcggatcaacaggtggttgcaactggacaaggcactagcgggactttgcaagtggtgaatccgcacctctggcaaccgggtgaaggttatctctalgaactgtgcgtcacagccaaaagccagacagagtgtgatatctacccgcttcgcgtcggcatccggtcagtggcagtgaagggcgaacagttcctgattaaccacaaaccgttctactttactggctttggtcgtcatgaaB.2
系统遗传进化树的构建
将所得到的致泻性大肠埃希氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定致泻性大肠埃希氏菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用cBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为示例图。562
.3.092
1283,15
：442
1033402086o
.12317
·287543
?@8037
.1104，578
10728485
0874073
237422
30692338
5872744
60321820
1595,2910
·3837
085.2889.1870.1869
部分致泻性大肠埃希氏菌系统遗传进化树图
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