本标准规定了食品中合成着色剂的液相色谱测定方法。 本标准适用于食品中11种合成着色剂（柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、喹啉黄和赤藓红）的测定。

中华人民共和国国家标准
GB 5009.35—2023
食品安全国家标准
食品中合成着色剂的测定
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
GB 5009.35—2023
生食品中合成着色剂的测定》、GB5009.141-本标准代替GB5009.35一2016《食品安全国家标准食品中诱感红的测定》、GB/T9695.6一2008《肉制品胭脂红着色剂测定》、
2016《食品安全国家标准
GB/T21916—2008《水果罐头中合成着色剂的测定高效液相色谱法》。
本标准与GB5009.35一2016相比，主要变化如下：增加了靛蓝、诱惑红、酸性红和喹啉黄4种合成着色剂；增加和明确了适用基质种类；
一修改了样品前处理方法和仪器条件；一修改了检出限和定量限。
1范围
食品安全国家标准
食品中合成着色剂的测定
本标准规定了食品中合成着色剂的液相色谱测定方法GB5009.35—2023
本标准适用于食品中11种合成着色剂（柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、喹啉黄和赤藓红)的测定原理
试样中的合成着色剂用乙醇氨水溶液提取，经固相萃取净化后，用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。
：试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇(CH.O)：色谱纯
甲醇(CH,O)。
石油醚：沸程30℃～60℃。
无水乙醇(C2H。O)。
氨水（NH3·H2O)：含量20%～25%。乙酸铵（CH,O2N)：色谱纯。
甲酸（CH2O2）：含量98%。
试剂配制
乙醇氨水溶液：量取无水乙醇700mL，加入4mL氨水，用水稀释至1L，混匀。5%甲醇水溶液：移取甲醇（3.1.2)5mL，用水稀释并定容至100mL，混匀。2%氨水甲醇溶液：移取2mL氨水，用甲醇（3.1.2)稀释至100mL。乙酸铵溶液（20mmol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000mL。乙酸铵缓冲溶液，pH=9.0：乙酸铵溶液（3.2.4)加氨水调pH至9.0。2%甲酸水溶液：移取甲酸2mL，用水稀释至100mL。标准品
3.3.1柠檬黄（CAS号：1934-21-0）：纯度95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.2
新红（CAS号：220658-76-4）：纯度≥95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。苋菜红（CAS号：915-67-3）：纯度≥95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。GB5009.35—2023
3.3.4靛蓝（CAS号：860-22-0）：纯度≥90.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.5
胭脂红（CAS号：2611-82-7）：纯度≥95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.6日落黄（CAS号：2783-94-0）：纯度≥90.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.7诱惑红（CAS号：25956-17-6）：纯度≥95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.8亮蓝（CAS号：3844-45-9）：纯度≥95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.9
酸性红（CAS号：3567-69-9）：纯度≥90.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.10
喹嘛黄（CAS号：8004-92-0）：纯度>95.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.11赤藓红（CAS号：16423-68-0）：纯度≥90.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备液（1.0mg/mL）：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、新红、菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、喹啉黄和赤藓红各100mg（精确至0.1mg），加水溶解并分别置于100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液。标准储备液可于4℃下避光保存6个月，靛蓝标准溶液临用现配，3.4.2混合标准中间液（50.0μg/mL）：吸取上述标准储备液（3.4.1）和靛蓝标准溶液（1.0mgmL）各5.00mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到混合标准中间液（各合成着色剂浓度均为50.0μg/mL），临用现配。
3.4.3标准系列工作液：吸取混合标准中间液（3.4.2）0.2mL、0.5ml、1.0mL、2.0mL、5.0mL和10.0mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到标准系列工作液。浓度分别为0.2uμg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL。4仪器和设备
高效液相色谱仪：带二极管阵列检测器。4.2
天平：感量分别为1mg和0.1mg。4.3
pH计：精度为0.01。
电动搅拌器：转速范围为30r/min～2000r/min。4.4
涡旋混合器。
超声波发生器或恒温摇床：超声功率不小于700W，控温范围为20℃～80℃；摇床转速范围为10r/min500r/min。
高速离心机：转速不小于15000r/min。4.7
固相萃取装置。
氮气浓缩装置。
WAX混合型弱阴离子交换反相吸附或等效固相萃取柱，150mg/6mL。4.114
针筒过滤器，PVDF（聚偏氟乙烯）或PTFE（聚四氟乙烯）滤膜，孔径为0.45μm。5分析步骤
样品前处理
5.1.1试样制备
液体试样和粉状固体试样应分别混合均匀，半固体试样取固液共存物进行匀浆混和，固体试样（带核蜜钱凉果需先去核，取可食部分)经电动搅拌器粉碎等方式混合均匀，密封，制备好的试样在一18℃2
以下避光保存，备用。
5.1.2试样提取
GB5009.35—2023
液体类试样（饮料、配制酒、调制乳、调味糖浆、风味发酵乳等）、冷冻饮品（风味冰、冰棍类）5.1.2.1
准确称取试样2g（精确至0.001g），冷冻饮品可先温水浴加热融化再称样，置于50mL具塞离心管中，加入适量乙醇氨水溶液（3.2.1），涡旋1min，5000r/min离心5min，并用乙醇氨水溶液（3.2.1）定容至50mL，即得提取液；准确吸取上清液10mL，50℃下氮气浓缩至3mL左右，分2次～3次共加入10mL5%甲醇水溶液溶解，作为待净化液。5.1.2.2固体类试样（加工水果、腌渍的蔬菜、糖果、酱及酱制品、香辛料、果冻、杂粮粉及其制品、面糊、淀粉及淀粉类制品、胶原蛋白肠衣、即食谷物、谷类和淀粉类甜品、糕点上彩装、蛋卷、焙烤食品馅料及表面用挂浆等）
准确称取试样2g（精确至0.001g），置于50mL具塞离心管中，先加人适量水（2mL～5mL），50℃水浴加热混匀样品，加入25mL乙醇氨水溶液（3.2.1），涡旋1min，50℃超声或振摇（速率250r/min）提取20min，8000r/min离心5min，取上清液置于50mL容量瓶中，每次加人约5mL~10mL乙醇氨水溶液（3.2.1)重复提取操作至上清液无明显颜色，离心后合并上清液，用乙醇氨水溶液（3.2.1)定容至50mL，即得提取液。准确吸取提取液10mL，50℃氮气浓缩至3mL左右，分2次～3次共加人10mL5%甲醇水溶液溶解，作为待净化液。5.1.2.3含油量较大的试样（可可制品、巧克力和巧克力制品、调制乳粉、调制奶油粉、调制炼乳、膨化食品、加工坚果与籽类、熟制豆类、糕点、熟肉制品、复合调味料和冰淇淋、雪糕等）准确称取试样2g（精确至0.001g），置于50mL具塞离心管中，加人20mL石油醚，涡旋1min，超声或振摇（速率≥250r/min）提取10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，油脂含量较高的可重复提取一次，弃去上清液，加入25mL乙醇氨水溶液（3.2.1），涡旋1min，50℃超声或振摇（速率》250r/min）提取20min，8000r/min离心5min（若离心后提取液仍然浑浊，可转人高速离心机专用管，15000r/min离心5min），取上清液置于50mL容量瓶中，按照5.1.2.2中“每次加人约5mL～10mL乙醇氨水溶液……作为待净化液”操作。5.1.3试样净化
5.1.3.1活化bzxZ.net
依次用6mL甲醇（3.1.2)和6mL水活化固相萃取柱（4.10），保持柱体湿润。5.1.3.2上样
活化后立即将5.1.2中的待净化液以2s～3s1滴的流速加载到固相萃取柱上。5.1.3.3淋洗
依次用6mL2%甲酸水溶液和6mL甲醇（3.1.2)淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽2min至柱体近干。
5.1.3.4洗脱
用6mL2%氨化甲醇溶液洗脱，分两次加入，每次3mL，流速低于2s～3s1滴，收集洗脱液，于3
GB5009.35—2023
50℃氮气浓缩至近干，准确加入2mLpH为9.0的乙酸铵缓冲溶液（3.2.5）溶解，溶液用针筒过滤器，孔径0.45um的滤膜过滤，弃去2滴5滴初滤液，取续滤液作为待测液。5.2
仪器参考条件
5.2.1色谱柱：C1g柱，4.6mmX250mm，5um，或同等性能色谱柱。5.2.2进样量：10μL。
5.2.3柱温：30℃。
5.2.4二极管阵列检测器波长范围：400nm～800nm，检测波长：415nm（柠檬黄、喹啉黄），520nm（新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红和赤藓红），610nm（靛蓝、亮蓝）。5.2.5参考洗脱梯度见表1，其中流动相A为20mmol/L乙酸铵溶液（3.2.4），流动相B为甲醇(3.1.1)。
表1参考洗脱梯度表
时间/min
标准曲线的制作
流速/（mL/min）
将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应物质的峰面积，以标准系列工作液中该物质的浓度为横坐标，以该物质峰面积的响应值为纵坐标，绘制标准曲线。11种标准物质溶液的高效液相色谱图参见附录A。
注：亮蓝通常呈现为两个峰，喹啉黄通常呈现为四个峰，应根据标准溶液出峰情况，以各色谱峰的峰面积之和计算含量。
5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到对应的峰面积，根据标准曲线计算得到待测液中的各物质浓度。
6分析结果的表述
试样中合成着色剂的含量按式(1)计算。X
式中：
c×V ×V?
Xm×1000
试样中合成着色剂的含量，单位为克每千克（g/kg）；...1)
GB5009.35—2023
由标准曲线计算得到的待测液中合成着色剂浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；一样品经净化洗脱后的最终定容体积，单位为毫升（mL）；样品提取液体积，单位为毫升（mL）；用于净化分取的样品提取液体积，单位为毫升（mL）；试样的取样量，单位为克（g)；—换算系数。
计算结果保留3位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%，8其他
本方法中，当样品取样量为2g，定容体积为2mL时，柠檬黄、新红、胭脂红、日落黄、喹啉黄、赤藓红的检出限均为0.5mg/kg，定量限均为1.5mg/kg，苋菜红、诱惑红、亮蓝、酸性红、靛蓝的检出限均为0.3mg/kg，定量限均为1.0mg/kg。5
GB5009.35—2023
附录A
标准溶液高效液相色谱图
11种合成着色剂标准溶液（10.0μg/mL)的高效液相色谱图见图A.1。mAU
说明：
柠檬黄；
胭脂红；
诱惑红；
喹啉黄3；
新红；
喹啉黄1；
酸性红；
喹啉黄4；
检测波长415nm
检测波长520nm
检测波长610nm
苋菜红；
日落黄；
亮蓝1；
赤藓红。
靛蓝；
喹啉黄2；
亮蓝2；
11种合成着色剂标准溶液（10.0μg/mL)高效液相色谱图30.01min
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