本文件描述了饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于饲料添加剂淫羊藿提取物中5种黄酮醇苷(淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I)的测定。 本文件中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I定量限均为0.2 g/kg。

ICS 65.120
CCS B 46
中华人民共和国国家标准
GB/T43810—2024
饲料添加剂淫羊藿提取物中
黄酮醇苷的测定
高效液相色谱法
Determination of flavonol glycosides in epimedium extract as feed additive-High performanceliquid chromatography2024-03-15发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-10-01实施
GB/T43810—2024
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请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中国医学科学院药用植物研究所、天津博菲德科技有限公司、湖南农业大学、北京爱绿生物科技有限公司、中国农业科学院饲料研究所。本文件主要起草人：张军民、张会艳、赵青余、汤超华、秦玉昌、郭宝林、邓雪娟、曾建国、姚浪群、张晶晶、刘秀斌、郭晓青、谷旭。1范围
饲料添加剂淫羊藿提取物中
黄酮醇苷的测定
高效液相色谱法
本文件描述了饲料添加剂淫羊藿提取物中黄酮醇苷的高效液相色谱测定方法GB/T43810—2024
本文件适用于饲料添加剂淫羊藿提取物中5种黄酮醇苷（淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I)的测定。
本文件中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I定量限均为0.2g/kg。规范性引用文件
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GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4原理
试样中的黄酮醇苷用甲醇溶液提取，高效液相色谱仪测定，外标法定量。5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水:GB/T6682，一级。
5.2甲醇：色谱纯。
5.3乙腈：色谱纯。
5.470%甲醇溶液：量取700mL甲醇（5.2）于1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。5.5标准储备溶液（2mg/mL）：准确称取淫羊藿苷（CAS：489-32-7，纯度≥96%）、朝藿定A（CAS：110623-72-8，纯度≥95%）、朝藿定B（CAS：110623-73-9，纯度≥95%）、朝藿定C（CAS：110642-44-9，纯度≥95%）、宝藿苷I（CAS：113558-15-9，纯度≥95%）各20mg（精确至0.01mg），分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇（5.2)溶解并定容，混匀。一18℃以下保存，有效期3个月。5.6混合标准中间溶液（200mg/L）：分别准确移取标准储备溶液（5.5）各1mL于10mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液（5.4）定容，混匀。于2℃～10℃保存，有效期3个月。5.7混合标准系列溶液：准确移取适量混合标准中间溶液（5.6），用70%甲醇溶液（5.4）配制成质量浓1
GB/T43810—2024
度分别为0.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L混合标准系列溶液。临用现配。
5.8微孔滤膜：0.45μm，有机系。6
仪器设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。分析天平：精度0.1mg和0.01mg。超声波清洗器。
离心机：转速不低于4000r/min。6.5
涡旋混匀器。
按GB/T20195制备样品，至少200g，粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛，充分混匀，装人密闭容器中，避光保存，备用。8试验步骤
平行做2份试验。称取0.25g试样（精确至0.1mg），置于50mL离心管中，加入30mL70%甲醇溶液（5.4），涡旋混匀1min，超声提取10min。于4000r/min离心5min，将上清液转移至100mL容量瓶中，残渣再用30mL70%甲醇溶液（5.4）提取，重复上述操作，合并上清液，用70%甲醇溶液（5.4）定容，混匀。移取适量提取液，4000r/min离心5min，用微孔滤膜（5.8）过滤，备用。宜20h内上机测定。
色谱参考条件
色谱参考条件如下：
色谱柱：C1：柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或性能相当者；流动相：A相为水（5.1），B相为乙腈（5.3），梯度洗脱程序见表1；b）
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
检测波长：270nm。
表1梯度洗脱程序
时间/min
A相/%
B相/%
8.3测定
时间/min
表1梯度洗脱程序（续）
A相/%
8.3.1混合标准系列溶液和试样溶液测定GB/T43810—2024
B相/%
在仪器的最佳条件下，分别取混合标准系列溶液（5.7)和试样溶液（8.1）上机测定。淫羊藿苷、朝藿定A、朝霍定B、朝霍定C和宝霍苷I混合标准溶液的高效液相色谱图见附录A，8.3.2定性
在相同试验条件下，试样溶液中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I的保留时间应与混合标准系列溶液（质量浓度相当)所对应组分的保留时间一致，其相对偏差在土2.5%之内。8.3.3定量
分别以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿苷I的质量浓度为横坐标、对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其线性相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内，如超出范围，用70%甲醇溶液（5.4)稀释后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。9试验数据处理
试样中淫羊藿昔、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和宝藿昔I的含量以质量分数；计，数值以克每千克（g/kg)表示。多点校准按公式（1)计算；单点校准按公式（2)计算：;
式中：
m×1000
试样中待测组分i的含量，单位为克每千克（g/kg）；p;
式中：
从标准曲线查得的试样溶液中待测组分i的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；试样定容的体积，单位为毫升（mL）；试样的质量，单位为克（g）；
换算系数；
超出标准曲线范围后的稀释倍数。w;
A;×psi ×V
AiXm×1000
试样中待测组分i的含量，单位为克每千克（g/kg）；试样溶液中待测组分i的色谱峰面积；标准溶液中待测组分i的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；·（1）
（2）
GB/T43810—2024
—试样定容的体积，单位为毫升（mL）；标准溶液中待测组分i的色谱峰面积；——试样的质量，单位为克（g）；换算系数；
超出标准曲线范围后的稀释倍数测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。10www.bzxz.net
精密度
在重复性条件下，含量<1g/kg时，2次独立测定结果与算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的7%；含量≥1g/kg时，2次独立测定结果与算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的5%。4
附录A
（资料性）
5种黄酮醇苷混合标准溶液液相色谱图5种黄酮醇苷混合标准溶液的液相色谱图见图A.1。550-
GB/T43810—2024
2345678910111213141516171819 2021222324 2526272829 30 31323334353637 38 39 401
标引序号说明：
朝藿定A；
朝蕾定B；
朝藿董定C；
4—淫羊藿；
5-—宝霍昔I。
5种黄酮醇苷混合标准溶液（50mg/L）的液相色谱图图A.1
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