本文件描述了应用全基因组单核苷酸多态性（wgSNP)方法对燕麦嗜酸菌西瓜亚种进行溯源检测的方法。 本文件适用于燕麦嗜酸菌西瓜亚种的分子溯源检测。

ICS65.020.20
CCSB16
中华人民共和国国家标准
GB/T43166-—2023
燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法Traceability detection of Acidovorax avenae subsp. citrull2023-09-07发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-04-01实施
GB/T43166-—2023
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1范围
燕麦磨酸菌西瓜亚种潮源检测方法GB/T431662023
本文件描述了应用全基因组单核苷酸多态性（WgSNP）方法对燕麦嗜酸菌西瓜亚种进行溯源检测的方法。
本文件适用于燕麦嗜酸菌西瓜亚种的分子潮源检测。2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
潮源traceability
对于二个未知产地的对象，依靠建立特定的技术，实现其原产地的追溯。注：潮源又称为“可追溯性”，3.2
系统发育树phylogenetictree
具有共同祖先的各物种间进化关系的树。注：在进化树中，每个分支节点代表其各分支的最近共同祖先，面节点间的线段长度对应演化距离。3.3
单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphismSNP在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。3.4
全基因组单核苷酸多态性wholegenomesinglenucleotidepolymorphism；wgSNP在全基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。4病菌的基本信息
中文名：燕麦嗜酸菌西瓜亚种，又称瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌、西瓜细菌性果腐病菌。学名.Acidovoratavenaesubsp.citrulli(Schaad etal.,1978)Willemset al.,1992最新命名：Acidovorarcitrulli（Schaadetal.)Schaadetal.，2008异名.Pseudomonasauenaesubsp.citrulli（Schaadetal.，1978)Huetal.,1991Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli Schaad etal.,1978分类地位：原核生物界（Procaryotae），变形菌门（Proteobacteria），β-变形菌纲（Betaproteobacteria），从毛单胞菌科（Comamonadaceae），噬酸菌属（Acidovoraz），西瓜亚种（Acidovoraxavenae.subsp.citrulli）。该病菌的其他相关资料见附录A。1
GB/T43166—2023
5方法原理
燕麦嗒酸菌西瓜亚种溯源检测方法的原理是通过全基因组测序技术发掘物种的WgSNP位点，基于得到的单核苷酸多态性信息构建系统发育树，进行聚类分析，从而对物种进行溯源归类。6仪器和器具
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压灭菌锅、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、电泳仪、凝胶成像系统、一20℃冰箱、水浴锅、解剖刀、离心管、银子移液器、冻存管、培养皿、酒精灯、接种针。
7试剂和培养基
酒精CTAB、PCRTaq酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、无菌超纯水.试剂：70
LB液休培养O
人晚蛋自陈10095醛母设机500g氯化钠00g，搅拌至完全溶解后，每分10mL分装到玻钢武管重LB盾体培养基：1L
衣作重加人16.0
以培养基均在高压
雅灭菌
天21C
8溯源检测方法
8.1检测流程
防明粉分装至维展瓶中
对熏麦嗒服菌西瓜亚进在谢的流国包插菌珠的宝化的提取纯化全基因组测序、数据评估质控、字列品对、SNP检测系统发育分新球艾蜡果创定检测流程见附录卫8.2菌株活化
在超净工作合环境中，将保存的菌株用LB固体培养基用接种针取量采用平板培养Ⅲ上划线法活化，于28℃恒温培美箱中倒培养2d3d备用8.3DNA提取与纯化
使用CTAB法或商业DNA提取试剂，对基因组DNA的提取方法见附录C，提取后通过PCR扩增仪对其进行PCR扩增，并用电泳仪对PCR产物进行电泳，最后使用凝胶成像系统进行检测。用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。8.4全基因组测序
以模式菌株（REF）或来源明确的菌株的全基因组序列为参考基因组，采用全基因组鸟枪法（WGS），利用测序仪对构建的PE（Paired-End）文库进行2×150bp测序，测序有效深度（SequencingDepth）应达到200X，即测序所得到的碱基（bp）总量与待测物种基因组（Genome）大小的比值应达到200
8.5数据评估质控
对待测物种测序的原始数据（rawreads）通过通用生物信息分析软件进行质量评估。然后通过通2
用生物信息分析软件进行质量剪切，确保得到的数据有效、准确。8.6序列比对
按照通用生物信息分析软件列出的流程开展序列比对：GB/T43166—2023
使用通用生物信息分析软件将待测物种基因组有效数据与参考基因组（8.4)进行比对；a)
使用通用生物信息分析软件转换比对结果的格式，并对其排序；b）
统计比对结果：
使用通用生物信息分析软件进行重复序列的标注（MarkDuplicates）；d)
根据比对结果进行余序列（duplicatereads）分析、插片段长度（insertsize）的分布等分析；e)
利用通用生物信息分析软件进行深度覆盖率统计分析。8.7SNP检测
利用通用生物信息分析软件的识别单倍型（HaplotypeCaller）算法分析待测物种基因组和参考基因组之间的基因型差异，对待测物种的SNP进行分析，得到变异信息并统计变异位点。8.8系统发育分析
将待测物种的全基因序列单核苷酸多态性位点按相同顺序串联起来，得到一条fasta序列（参考附录D），然后将每个菌株等长的fasta序列输人到建树分析软件，再通过系统发育树邻接法（NJ法）基于WgSNP构建系统发育树，对菌株（含参考菌株）进行亲缘关系分析。9结果判定
根据待测物种序列在系统进化树上与已知来源的燕麦嗜蔽菌西瓜亚种的分支聚集结果进行判定：如果待溯源物种与已知来源物种序列聚为一支，支持率为100%，即可判定待溯源物种与已知溯源物种具有相同的来源地；
—如果待溯源物种与已知来源物种序列聚为一支，支持率低于100%，即可判定该物种与已知溯源物种疑似为相同的来源地；
一—如果待溯源物种未与已知来源物种序列聚为一支，则判定该物种与已知溯源物种不是同一来源地。
10样品与原始数据保存
10.1样品保存
分离得到的菌种转移至LB液体培养基，在恒温摇床中28℃培养36h，加人20%灭菌甘油，置于一80℃条件下保存至少12个月或采用无菌水保存法，严格防止扩散，保存期满后，经高温高压灭菌处理。
10.2结果记录保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR产物凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测序全基因组序列需要保存电子文件。3
GB/T43166—2023
A.1分布
附录A
（资料性）
基本信息
亚洲：中国、印度尼西亚、伊朗、以色列、日本、马来西亚、韩国、泰国、土耳其。欧洲：希腊、匈牙利、意大利、荷兰、塞尔维亚北美洲：加拿大、哥斯达黎加、瓜德罗普岛、尼加拉瓜、特立尼达和多巴毒、美国。大洋洲：澳大利亚、关岗、北马里亚纳群高。南美洲：巴西
寄主范围
辣椒（Cpsicunannuum），西瓜（Citrulluslanatus）、甜瓜（Cucumiselo）罗马甜瓜（C.melo
var.canatupeis）（emeloyamakieou网纹原（emelovrretiaatn、哈密瓜（Cmelo
war.saccarin）、黄瓜南ha西产（pepo）tum）胡叔（Fpernigruammelougena）。A.3
为害症状
该病害主要侵染植株的
斑，真叶受
香茄ycorsiconEscalen
子叶受剪为害时营面常出现水没快，沿叶脉逐渐发展、真叶利集实。
初为水漫状斑，浴续色小点，周围家新形成黄色量圈病斑沿叶脉发呈黑褐色坏苑
玉丰电
家色角斑或不规则去来实到为害时，最韧果皮上妞现夜我意米的水没获四陷斑点，随展成暗
展呈暗绿色或福这不现妞家的我班用鲜剖扭最了润观可观家病原可透过果皮进后迅速抗
人果肉，有时皇礼洞状
果实胸瓷有的病斑表皮健瘦，雅滋贴桐、透明、班珀色随脓附录B
（资料性）
燕麦嗜酸菌西瓜亚种潮源检测流程燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测流程见图B.1。活化菌株
DNA提取与纯化
全基因组激序
数据评估质控
序列比对
系统发育分析
结果判定
样品与原始数据及
SNP检
燕麦嗜酸菌西瓜亚种湖源检测流程GB/T43166--2023
GB/T43166--2023
C.1DNA制备
附录C
(资料性）
基因组DNA制备
使用下列CTAB方法提取病菌DNA，或使用商业化试剂盒提取DNA。a）菌株的培养及DNA制备的前处理。1）将菌株接种于装有LB液体培养基试管中，置于恒温摇床上28℃摇培28h。2）在试管中加人0.1mol/L磷酸钠缓冲液10mL洗下菌体。将细菌悬浮液转移至灭菌的离心管中，置于冷冻离心机中12000g下离心15min，弃上3）象
消液。
b）DNA的提取。
1）在沉淀中加人TE缓冲液5mL10%SDS溶液300μL，20mg/mL蛋白酶K30μL，混匀37℃置水浴锅中水浴1h。
加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1)，混匀，10000g离心5min，将上清液转移至新的2）S
灭菌离心管中。
加人等体积的酚/三甲烷/异戊醇（25：24：1）混匀，10000g离心5min，将上清液转移3）
至新的灭菌离心管中。
加人0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀下来，10000g离心5min，弃上清液。4）
5）用1mL的70%乙醇沉淀洗涤后，离心弃乙醇，在超净工作台中晾干，加人50LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20℃可长期保存。C.2DNA浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，按照公式(C.1)计算DNA纯度，按照公式(C.2)计算DNA浓度：OD260
式中：
conc.DNA纯度；
p=50×OD2eo
一DNA质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；ODz55—260nm处吸光光度值，核酸的吸光度；ODzss—280nm处吸光光度值，蛋白质的吸光度。PCR级DNA溶液的ODzo/ODzso比值为1.7～1.9。6
参考菌株wgSNP位点序列
附录D
（资料性）
参考菌株wgSNP位点序列
GB/T43166—2023
CTTTTAGTGATTCAACTGGGACCGTCAGGCCTCGCCGATCGTTCCGGTGGTGAAACTTCATGCGTGGGTATCCGGCTCTATCGTACTCCACTCGACTTAGTCGGGTCGGGCCAGGCCTCACGTTCCTTAGCGATGTTGAATCTCCACGTGCTGGGTGTTTCGCGGGCCCGCGGCATGGTCTGTGCTCTAACGGCGTCACGACAGCCTTGTCTGACTGGGATCAGGGGTGCCGGTCTCGGACCTACTCACGTGGCCGTCGGCCACATTCGACGCACGGGCGCTCCACGACCTGGCCCCCTGCTTGCAGTCTCAATTATCGGCCTGGGGAATGTCGTGGTCGGATTACACGGGTGGTGATCCCGGTTGGGCCACGATTTGGCACCATTTTAAGCCACCAGTCGAGGGCCCAGAATCGTGGGTATCCGTCCCAGTAGCCTATGCACGCACTTTGTGCCGTAGGGCGGGGCGGTGTTGCGGGCGGAGGGCGCTGGACGGGTGGCACGCGGGTGCATACTTCGCTATGGTAAGCTGATGTTACACCGTTGCCTGTAGGCAAGGGTGCCGGAGTCTGCCGGACGAGCGCCCGGGGTTTCTGTTATAATCAGCGGCGATCGCCCTGCCGTCGCACTGGAGTGCTAGTAGGGTCTGCCTACATAGGGAATTTTGAACGCGGATTCGGACGTGACCAGCTGGTCTCCCATACCGCTCGTAAAACGGCGGCTGAGCCCGTGGCCGTCCTCCGCGCGATCCGGCCCGTCGCCTCGTCGTATCCGGCCTTATGGGGAGGGATCCCCGCCTCTCCAAGGCGCCAAGTGGTCACCACTGTCCCTGCTCGGTCCCCCCTCATCGGCCGGGCCTGCTTGCGCCCTTTTCCGCATTGGGATAGCGGGTGAGGTTTCCTTCCGTGCGGCGCTTGCACAGGAAGGGGTGGAGTCTTGTTATCGGACTAGTGAATAGTGCCCGATCCTGGATCGATTGCACCAGCTTATGAGCTTGGGATCGTGAGAGGCGAGGACGGTCCACCCTCAGGGCCGCAAGTTTGTATATGTCTGGGAGCTCACGCAGCGCTACGAACGGCGGTAAGTAAGGAGGGGCACCCTGACCTGAGTGTTCGTGCCGGATGCCCACTACCCTTTCCACCAGCTTCCCCCCAGATGTGGCAGAGACTCTGTTGCTTTACTGTGTTTTCCTAAGGAAGTCATCGGGAATAACGAGATGAGACCATGTCTCGTCCACGATCGGCCGCACGCTCCCCAGTGCGACGGGTGCCGCGTGGGAGCTGCGAGAACAAGGCGTTCTGGTAAAGACCGACTAGCTGGCCGGCGTTCTGGCGCGCCGGCTCCGACACAGCCGGTCGCACGCTGATCGACAACGTTGCCTATTTTCCAGCCTGCCTGACACCAGGCAGGATTGCACTTTGGGTGCGGCGCATCTGGCCCCCTCCCCTGATCTCGATGATCATACCAGCTTTGCACATCGCACGCGTAAAGGCTAAACCGTAAGCGGGCTTTGGTCCCCGCTGTGGCCAGCCCCAGATCGAAGCGCCGGTGTACGCTATCAAGGGCGTTTTCACATGTCTGCCAGAGGTGCTCGGCTGGCGGCCCGACTACATAGCCAACGTCGACTCAGACATTGGCAGTGCCTCTCGGCGCTGCCCCGGCCGTCGCGGGGGTTAGGGCGAGGTCAATGCGGGGGCCCCTGTAGTCGCCTGAGGCGTAGTTTCTTGTCGTTCAATGGCTCGCCCGCTATTGGGACAACCTGCGGTCAGTTGTTCTAGCGGCTGCAAGTCGGACACCAGTGTGCGGTCGCGCCTCGTCGCCTGACACCGATGTCACGCGTTTTCCCGGAGGCAACGTGTGGTGTGTGCGTAATGCTCCTCGGGAATGGAAGTGGGGGCTGCGGACCGCCCCGCACTAGACGTGACCGGCTCTGTGTGCGACCTTGTAGTGAGGTGCACCCAGTGAGTTGGCTGGGTCTCTGTGTGGGAGCTGCTTTAAACGTGTAGTGCGTACACGCCAGATCCATCAAACCCCCAGATGCTGTGCCGCTCGGCGTCTATGGTGAGCCAGGGACGCCGGGCGTGGGCCGCTCCGGTGCGAGTCTGGCTCCGCGCTTCTCGGTATGCGCCTCCTGAACGGCTGGGCCCGACGATCGAACACCGACGCGGAGTGTTGTGTGCACCCTAGCCCGGCCGTAGTGCCTCGAGCCTTGAAGGCGCCTTGGTTAAGGCACAGCTCTGAGCCCTGTCCTGTTTCTGTGTGCGTCCGGCCACGATCCGAAACACCGGGGCGCGTGATCCGCCGGGGTCCTTCGCGCCGCGCGTCCTATCAGCATCACTTGGACGCGGAACGTGCATCGCTCACACTGATTCACAGGTTGCCGCACTGGAGCCCCCGACGACCGCCGGGCAAGAGGTCAGCATAATCGCCCAGGACGGCCCGTCTGCTATCGGCGGCTGTGGTGTTGTTCTTTTTCC7
GB/T43166—2023
TTGCCGCCCTCGGAGCACTCCCGAGGCATGGCAAGATGTAGTACTCTCGAAATAGCAGCTCTACTACGATTACGACGGTTTCTCCCCCCGTGGAGCGGAGGCAAGCGAGGTTCTGGACGGCTGCTCTTCGGAGGCGCCCCGGGTTACTCCGTCGTGAGGCGTAGACAGCCACTATGGCTTATCGACAACTTCCTTAATTTTCCTCCATAGCCGTCCGAAGTTCTAATACAACTGCTATAAATCCCAACCTACCGGGTACACATGTTTCGGGGCGGACGGTCGTGTTGTAACTTAGGCGATAGTTCGTTTGATGTAGTATTCACACTTTTCGTCAACCCCGACGGGCCCGCGTGGGCGACCGGGGGCGCCTCGGCGCCGCCACAGAAGCGTCCGGGGGGTCCCGGGCTTGCTTAAGCCATACGGGGTGTAGTTCTCCCTACGAAGCTACAGGCTTTTCCAGCCACTGTTGCATAGTTACCAGATTAAGCCTTCACAAACGCCGTGCTCGCGACGCGGGCCACTGCGTCGGACTATCACTACCTTGTTATATCCGAGACGCAACGAAGCCCGCACGCCGTTAGGCAATGGTTTTCCGCAACGCCCCGTAAGGCCGTACCATAGTCCGCGCCTTCCGCCGCCGCATCAGAGAGGGCGATCCGCCTGCGAGGTGAGATTGGGGGGCAGGGCGATGCCCCGGGTGCGTACTTGGCACCGCAGATACTTCACATTTGTTGTGCGGCAGCCCTTAGTCACCAGGTTGTCGACGCGGTCATGAAGCCGTGCGCCACCTGGGCCCACCCGCACGCCGGTCACATGCGCGAAGGTGGTTGCCGAGCGCCCTTGGCGGGCAACATACTTCCGCCCTCCCGGCTCGTGCGTGTCGCCCCTCAAGACGCACTCACAAGAGAGTCCGCCCCTAATCTTCCCTGTCATTATACCCCTATGGTCACCCCTAGCAGCGTATTGAACAGTGGTCACCGAGGAGGCCGCGTGTCCGGCGCGGACCCCGCTATACTTTCCACCTCCTTTGGTTGGGATGGATGGCCTTTATACATTCGCGGTTACAACATCGTTAGGTGCGTCGTCCTCGAAGCAGGACTGTGGACCGTATCCTGGCGAGCTCACCGGCTTGGCCACTCTCGGTCGGCTACTCAAATTAATCACCGCCCGACCACGACTCTCTGGGCCAACCCGGCTGTGGGCTTTGGTCATAAACATCGAGGTGCACACTAAGGCTATAGGACCGCAATTGAGGCAATCAGTCTGACTTACCGCTCTCGACCGTAGCCATCATTTACCCTGGGTACTTTTGTCATGTGAACCCCCCGTCCTCCACCCGGAGGATTTGGCGGAACTGTCACACCCTATTCACACTCGGCTCCGCCGCGGGCAATCCCAGTGAGAGCGCGGCCTGCATCCCCTTGGCAATTCAAATCTGTGAGCTCATCCCATCACAGCCGACGGATGGTGCCCTTTTGCTGTTTGCACGGCCTGTCACCTGGCGTCATTTCCATCACATCTAGTACTCCGCCAGGGCGGATAAGAGCGAACTCCTTAAGAACTGCCCCCGGGGCTCATCCCCAGGTGGCAGGTCCTATAGTGGCTCAGCGGGATATAGCAGGAGCCACTGCTAGATAAAGTTGTTGAGGCTCTGACGCTTACCGCCGGCGCGGTGTGGTGTCGACGCGGCGCTTGTGCTCCCCGGTGCCCTCTCGTCGCGTCCCCGCCGTTCGGCAATGGGAGGCACGGGAGCGCTGGTCCGCCCAGTTCGGGAGTTGCGTTTGCCGGGGGATGATACGGCCACCACGGACCCATTTGGCTAATATGAGCGGCCAAATCTGGGGTGCTCGTTTGACTGTTCAAGTGTCTTCGTCCTATGCCTGCCTGGTGGTGCGATGTACCGACGCTTCCTGCACTTGACTGAGATATGCAGCCGTTAGCCCGCGTGGCCCACGTCCTTTTCACTGTATCTGCCGAATCGCGTCATCTACGACAGTAATTGTCGACGAAGTGGGACAGTACATATAGCCCTTTTACAGGAGAGTCCAATGACTACACTCTTCCCAGGACCGGAGATGGCTTCTTGTGGGGCCTCCTACCCCTGGCCCCCTCACACCGCGCCGAAGTTTGGTTAGATTGATCTAAGGCCTCGCCCCACGCCGCGCTGGTCGAGTTGAGGGACCCATCCCGTCGGTCGGCAACATGAGACATTCGACGTTCTGCCTTCATGGCTACAAAGGCGGTTCTTCAGTCAATCCAACCTTCGCCCAGGACCCAGGTGCAATAAGTAAGCTGGCGGTGAAGCCGCCCACGTGCCCGGATCCGCCGCCCGGCGGTCCCAGCACGTAATTGAGGAGACGTGTCCCGCGAGCGTGATCGGTCTGGCCTACCTCGGAGCCCTCCTTCGTATCACAATGCAAGTAACTGCTCGACTTGTGCCCGAGCTCAGGTATTCGCGCACCCCCACGGGAGTACAAGGCGAAGGCTGCCCTTACCTCGAGAGCGCTGATTTGCACCGTGCGGTGGCGACAGTCTTTGTTAGTAGGGGCGCCAACATCGGCACCTACTGGTCATGTTTCCACCGCGCGAGAACACAGTGCGGGTTATCACTGGTTCCGCGCTAACGCCGCTAACATTCTCCGCAATGACCCGTTGGCTTTAAAACGCGCGAACAAGGTGGCACGTGTAACAGGTAATACGTGATTGCCGATCTTCCGCGCGTTGCCATGTCTGCGTAGCGGCTGTTATTCGTTGTCTAGCGCGAGAGCGGGCCCATTGGCATGATTTCCCCGGTCCGCCTGGGAGGGGCGGCTGGGCGCCGGGCGTTCCCGCTCCCAGGCTACACCGGACGCCAAACGACATTCTGCGCGCCGCCGTCCACCCCATTGCTTACTCCGTCCGAGCGCCAGGGCCGCGAGGCATGCGGAGCTCAGGTAGATATCAACTCTCAGGGGCTCCCCGCGGG8
GB/T43166—2023
CACTCGCGATCAAAACCTATCTGCGCTCCGACGGGGTCCTCACGCACGGGGATGTCAAACCGCGCACGGCTGTCACCTCGTCGCCCCACACGAGTGCAAATCGTAGGTAGGGGCCCTATACATACGGCGCGGTTACTACTCCCCCCGGGGCGCTACGCCCTCCCCTGGTCCGCGTCCAGCTTTTCGCTCAAGGAGGCCGCAGGGGGACCGTGCGCGGCGGAGCGAGCAATATGTCATGTCGGATCCCAAGGGAATAACACCGGGTGCGGACCTCGGAATAGGGGAGATCGGGGGACGTAGATCACCGAGAGGCCTGCACGTGCTCGAAGGACGCTTAGGACGACGAGGGTGGTTGCAAGGTCGCGGGTGGTTACCCCGCCGCCTCCGACAGCGCGCGATGGGGCTCAACTCCCCCCCCTGGGCACGCGACCACACGGGGATGCATTTATTAACTTGCGTGCTGGATAGAGACCAGTTATTCAGCCCTAAACTACTCTTAATTAAGTTTTGTAGGCTATCGGAGAATCCTTGATAAGAGTCCGCCCGAGGATTCGAGTGGAAGCTCGGATACTAATT
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GCOGTGCCCAAACS
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CCGTGTCCGCCCACTTTCCCGCCAACCTAGCCACCCTGCACTACGTTCCGGATAGACGAGTTGCATGC
CGCCCGTGTTCOTGCCTCATTCTAGTTTCCTCCTGCATGCTGTTGCGGATTCCCTTAAGGTTTTGGTAACGCGCCCTCCTCOGTAAACCTAGGGGCGTCTTAACCGAAGATAAGAGCSGACCICGTTCTAATAGCGAGGGCGCGGACCGCAOCAATAGGACAGATGCTACTCATGTATACAGACCTCTGCTTCAAAGGGACTCGGACGTCATAATCCCATGCTCAGATAATAGTAAACGGGAACTAGAACAAAAAGATTTAGTTTACGTGGACTGTTGGTCAGCAATAAACACATCAACCTAGAACCCAAGGACTGCCAAAAGCATGTAAGCAAATCCTAGTCAGGTAGGGTGGAGAGCCACCACGCAACGGCGGGCCGGOCCTGTGGCGCAAGCTGAAGGCAAACTAGCCCAGCGGAGCGCCTAGCAAGGCTGGTCACCATACGTCACTGCTGCAGGGGAGCTGCCGAGGGCGTTTAAGACGCGGGACCGTCACGCTACCGAGGTTGTCGCTCTTGGATGGAACCAGAGTACGGGACCAGCAGCAAACCAAGAGAAAGAGTAAAGCTGGGATGTTCTCTGAAGCGGGACCAAAGAGAACATCGAGCGACGTCCTTGGACGGTTGGGACGGGGCAATAGCGCGCTCTACAATGACCGCCCCTTTTAATGTGGCATGGTCGGGCGTCTCCTGAGGCCTCTCTGTATGTAGACGATGCCTGCCAGGGACTCAGTGATTACCTGGATGACATCGTGTCTCCATOTGCCGATCAGTCCGAGGAGCCGCGAGCCCGTTGGCAGTCTTCCACGCACGATTCTCGACCGAGCGCCGATCCCCCGTTCCCGCGCGGTGGCCGCCGAGATGGCACACGCGAACTACCATCGCGCTAGACGCACTGGGGCCGACCGGAGTTCATGGAACGGACAAGGCAGCAGGAACCGTTGCATGATCAGCCGCGGAGGTCCGCTAAGGAGCCAGGATGGCGCACACCGGTCTTGACCGACGAGCGATTATGCACAAGCCCATGATGGTTAAGCGGCTCATTATCGAACGGTCTCATGCAAACTGCATAACCTGCCCAGACCCCCTCACTGAAGTCGACCTAGCCTTACTTCTTAAGTCGCGCCCACCCATAGGCAACAGGGCAAAGACTCCCATTGCATC9
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