本标准规定了动物性水产品及其制品中颚口线虫幼虫的形态学和PCR检验方法。 本标准适用于动物性水产品及其制品中颚口线虫幼虫的检验。

中华人民共和国国家标准
GB31610.1—2023
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中颚口线虫的检验2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
1范围
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中颚口线虫的检验GB31610.1—2023
本标准规定了动物性水产品及其制品中颗口线虫（Gnathostoma）幼虫的形态学和PCR检验方法。本标准适用于动物性水产品及其制品中题口线虫幼虫的检验。2原理
动物性水产品及其制品中的颚口线虫幼虫主要寄生于淡水鱼类、两栖类等水产品的肌肉等组织内用胃蛋白酶消化动物宿主组织获得虫体，根据幼虫的形态特征，判断颚口线虫属幼虫。对可疑虫体通过扩增颗口线虫线粒体细胞色素C氧化酶第I亚基（co1）基因片段并测序，进行常见颗口线虫幼虫的鉴定。
仪器和设备
生物显微镜：100×~400×，
体视显微镜：7.5×~150×。
PCR扩增仪。
凝胶成像系统，
电泳仪。
恒温培养箱：37℃1℃。
磁力搅拌器。
高速离心机：转速≥12000r/min网筛：孔径2mm（10日）
锥形量杯：1000ml
微量移液器：0.2μl~2.5μL1μL~10μL10μL~100L、100μL~1000μL试剂和材料
4.1试剂
盐酸：36%~38%HCI溶液
生理盐水：0.85%NaCI溶液。
1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)。
0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）
10%SDS溶液。
5mol/L.NaCI溶液。
3000U/mg胃蛋白酶。
GB31610.1-—2023
20mg/mL蛋白酶K。
苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)）。5U/L耐热DNA聚合酶
10×PCR缓冲液。
25mmol/LMgCl..
dNTPs：dATP、dTTPdCTP.dGTP，每种浓度为2.5mmol/L。琼脂糖：电泳级。
50×TAE缓冲液·使用前用去离子水稀释成1XTAE缓冲液。IXTE溶液（pH8.0)。
10mg/ml溴化乙锭（EB)或其他核酸染料。6×上样缓冲液。
100bp~2000bpDNA分子量标准。
引物：浓度为10amol/L。
正向引物
FH5：5-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTA-3反向引物MCOIB.5-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATGAGC-3扩增显口线虫cor1基因片段长度为441bp。4.2试剂配制
4.2.1生理盐水：称取8.5gNaCI溶解于900mL去离子水，再加去离子水至1000mL。4.2.21mol/1Tris-HCI溶液：称取121.1gTris（三羟甲基氨基甲烷）溶解于800ml去离子水.用盐酸调节pH至8.0.加去离子水至1000mL。4.2.30.5mol/LEDTA溶液：称取186.1gNaEDTA·2H，O（二水合乙二胺四乙酸二钠）溶解于800mL去离子水.搅拌溶解，用NaOH调节pH至8.0,加去离子水至1000mlL4.2.45mol/l.NaCI溶液：称取292.5gNaCl溶解于900mL去离子水，再加去离子水至1000mL4.2.5胃蛋白酶消化液：取胃蛋白酶5g，溶解于900mL生理盐水中，加盐酸7ml，混匀.再加生理盐水至1000mL，临用现配。
裂解液：10%SDS溶液100ml、1mol/LTris-HCI溶液10mL0.5mol/L,EDTA溶液4.2.6
200mL、5mol/LNaCl溶液20mL.加灭菌去离子水至1000mLe4.2.71.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g·加入1×TAE缓冲液至100mL，加热至完全融化后冷却至60℃~70℃.加入10mg/mL溴化乙锭5L.混匀·制备凝胶。检测方法
形态学方法
5.1.1取样
取动物性水产品或其制品肌肉组织.剪成小块。5.1.2消化
取5.1.1样品200g置烧杯中.按照样品与胃蛋白酶消化液1*5的质量体积比加人消化液混匀，于37℃士1℃恒温培养箱应用磁力搅拌器恒温搅拌消化4h16h.使肌肉完全消化。可根据不同水产品种类以及消化时间对胃蛋白酶浓度和使用量进行调整2
5.1.3过滤
GB31610.1-2023
消化后的悬液用网筛过滤，并用生理盐水冲洗网筛上的残留物。收集滤液置于锥形量杯内，搅拌后静置沉淀15min~30min。轻轻倾去上清液.加人适量生理盐水，搅拌后再静置沉淀15min~30min。重复洗涤3次～5次·直至上清液透明为止·流淀备用。5.1.4镜检
全部沉淀分次转移至玻璃平血，在体视显微镜下去除沉淀中的杂质，分离收集沉淀中的虫体或含虫体的包囊（鉴定时撕开包囊，取出虫体）。淡水鱼类、两栖类等动物性水产品及其制品中的额口线虫为第三期幼虫，虫体呈圆柱形，较粗壮。活虫体呈淡红色、淡黄色或粉红色，半透明，头部和尾部均弯向腹面，部分呈卷曲\G软，虫体长度因虫种不同而异，为0.6mm~11mm，头部近似球形（称买球），尾部送渐变细呈锥形食道、肠管颜色较深。挑出具备上述特征的虫体在生物显微镜下进一步观察。颚口线虫第三期幼虫头球与虫体驱体部分分界明显，头球前端有两片向外突起的肉质唇围绕口，头球表面排列有3环或4环小钩，体表环列有横纹和小棘·体前部棘明显大而密，体后部棘渐小而疏.尾部光滑圆钝。有1对颈乳突，1个排泄孔。食道呈棒状，分肌质部和腺质部，食道周围有4个肌质管状的颈囊环绕：肠管粗大或细长，肠内充满黄褐色颗粒。口线虫第三期幼虫的形态特征见附录A，其模式图见图A.1，实物图见图A.2~图A.13。5.1.5结果判定
在动物性水产品及其制品中检测到具备5.1.4特征的虫体，可判断为额口线虫属幼。对疑似额口线虫属幼虫立即用于DVA提取或保存于一20℃用于PCR方法鉴定。5.2PCR方法
5.2.1DNA提取
取5.1.5判断为疑似题口线虫幼虫的虫体1条，用生理盐水洗净.放人1.5mL离心管中，加裂解液500L和蛋白酶K10L.55C振荡消化至虫体被完全消化（1h~3h）在混合液中加人苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）240mL，混勺，4℃12000r/min离心10min。吸上清液（约500L）加人新的1.5mL离心管.加人500L预冷的无水乙醇（一20℃），充分混匀.放人一20℃沉淀1h，4℃12000r/min离心15min沉淀用70%乙醇500μL离心洗涤2次，每次4℃12000r/min离心3min。倒干乙醇37℃干燥后加人1×TE溶液100L溶解DNA，立即用于检测或一20℃保存备用。注：根据实验室实际情况，可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取DNA。5.2.2PCR反应体系
在PCR管中依次加人10XPCR缓冲液5.0L、MgCl5.0LdNTPs4.0L、正向引物和反向引物各1.0L耐热DNA聚合酶0.4L、DNA模板2.0L加灭菌去离子水至总体积50L。每次试验需设阳性对照和空白对照，阳性对照用额口线虫DNA或含有自标基因序列的质控品，空白对照用灭菌去离子水做模板。
5.2.3PCR反应条件
94℃预变性3min：94℃变性30s.58℃退火30s72℃延伸45s，35个循环：72℃延伸7min4℃保存。
GB31610.12023
5.2.4电泳
取PCR扩增产物10uL与6×上样缓冲液2L混合，加样于1.5%琼脂糖凝胶中，其中一孔加人DNA分子量标准。在1XTAE电泳缓冲液.5V/cm恒压电泳30min~40min.用凝胶成像系统观察和记录结果。
5.2.5PCR结果判定
阳性对照出现预期大小的条带（441bp），空白对照无条带，待测样品扩增出预期大小的条带，可判定PCR结果为阳性：无扩增条带或未扩增出预期大小的条带均判为PCR结果阴性。取PCR结果为阳性的PCR产物进行基因序列双向测序，将测序结果与口线虫参考序列（见附录B)进行同源性比对
结果报告
6.1形态学方法检出颚口线虫属幼虫·报告检出颚口线虫幼虫。6.2形态学方法检出疑似口线虫属幼虫、PCR结果为阳性且扩增片段基因序列与颗口线虫任何一条参考序列同源性≥96%，报告检出颚口线虫幼虫。6.3形态学方法未检出题口线虫属幼虫、或PCR结果为阴性、或扩增片段基因序列与颚口线虫参考序列同源性96%，均报告未检出题额口线虫幼虫。附录A
颗口线虫第三期幼虫形态
A.1颚口线虫第三期幼虫模式图见图A.门
实球和
环列小
颈乳突
排洲孔
颚口线虫第三期幼虫模式图
A.2颚口线虫第三期幼虫实物图见图A.2~图A.13。e
消化沉淀中的虫体
图A.5虫体呈粉红色
虫体外观
虫体呈淡红色
GB31610.1—2023
包囊中的虫体
虫体呈淡黄色
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头球和
横纹和
示头部及体表
排泄孔
示排泄孔
图A.9示头球上3环小钩
图A.12示食道与肠管
图A.10示颈囊
示肛门
附录B
颗口线虫参考序列
棘题口线虫（Gnathostomaspinigerum）cox1参考序列GB31610.1-2023
TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATATTTTAATTTTGCCTGCTTTTGGAATTGTTAGTCAGAGTAGTTTGTATTTGACAGGTAAAAAAGAGATTTTTGGTTCCTTAGGTATGGTTTATGCTATTTTAAGGATTGGTTTGATTGGTTGTGTGGTTTGGGCTCATCATATATATACGGTGGGGATGGATTTGGATTCTCGTGCTTATTTTACAGCTGCTACTATGGTGATTGCTGTACCTACGGGGGTGAAGGTTTTTAGATGGTTGGCTACTTTGTATGGTTTTCGTATGATGTTTTCTCCTTTGTTGTTGTGGGTATTGGGTTTTATTTTTTTGTTTACTGTTGGGGGGTTGACTGGCGTAATGTTGTCTAATTCTAGTTTGGATATTATTCTTCATGATACTTATTATGTTGTTGCTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAB.2
日本题口线虫（Gnathostomanipponicum）cox1参考序列TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATATTTTGATTTTGCCAGCTTTTGGGATCGTTAGTCAAAGAAGATTGTATTTGACTGGTAAGAAGGAAATTTTTGGTTCTTTGGGGATAGTATATGCTATTTTAAGAATTGGTTTAATTGGTTGTGTGGTTTGGGCTCATCATATGTATACGGTAGGTATAGATTTAGATTCTCGTGCTTATTTTACTGCTGCTACTATGGTAATTGCTGTTCCCACTGGAGTTAAAGTTTTTAGATGATTGGCTACTTTATATGGTTTTCGTATAATGTTTTCTCCTCTTTTATTATGGGTTTTAGGGTTTATTTTTTTATTTACAGTGGGAGGTTTAACTGGTGTTATACTATCTAATTCTAGTTTAGATATTATTCTTCACGATACTTATTATGTTGTAGCTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAB.3
杜氏颚口线虫（Gnathostomadoloresi）cor1参考序列TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATATTTTGATTTTGCCTGCTTTTGGTATTGTGAGTCAGAGAAGTTTGTATTTGACTGGTAAGAAGGAGGTATTTGGATCTTTGGGTATGGTTTATGCTATTTTAAGTATTGGGCTGATTGGTTGTGTGGTTTGAGCGCATCATATGTATACGGTTGGTATAGATTTGGATTCTCGGGCCTATTTTACGGCTGCTACTATAGTGATTGCTGTTCCTACTGGGGTGAAGGTTTTTAGATGGTTGGCTACTTTGTATGGGTTTCATATAGTTTTTTCTCCTTTGTTGTTATGGGTTATAGGGTTTATTTTTTTGTTTACAGTGGGGGGTTTGACTGGTGTTATACTGTCTAACTCTAGTTTGGATATTATTTTACATGATACTTATTATGTAGTGGCTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAB.4
刚刺题口线虫（Gnathostomahispidum）cox1参考序列TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATATTTTAATTTTGCCTGCTTTTGGTATTGTTAGTCAGAGAAGTTTGTATTTGACTGGTAAGAAGGAGATTTTTGGGTCTTTAGGAATGGTATATGCTATTTTGAGGATTGGTTTAATTGGTTGTGTGGTTTGGGCTCATCATATGTATACAGTAGGGATGGATTTGGATTCTCGTGCTTATTTTACAGCTGCTACTATGGTAATTGCTGTGCCGACTGGGGTTAAGGTATTTAGTTGGTTGGCGACTTTGTATGGGTTTCGGATGGTTTTTTCTCCTTTGTTGTTGTGGGTGTTGGGTTTTATTTTTTTGTTTACTATGGGTGGGTTAACAGGAGTTATGTTGTCTAATTCAAGTTTGGATATTATTTTACATGATACTTATTATGTAGTTGCTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTA7
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