中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1444—2004 大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescent antibody technique for epidemic hemorrhagic fever of rats 2004-06-01发布 2004-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 本标准的附录A为规范性附录。 前言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：胡永、李树清、王巧全、徐纪。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了间接免疫荧光试验检测大鼠流行性出血热抗体的方法。 本标准适用于大鼠流行性出血热的检疫、流行病学调查和免疫监测。 2 材料 2.1 试剂 2.1.1 磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O)。 2.1.2 磷酸二氢钾 (KH2PO4)。 2.1.3 氯化钠 (NaCl)。 2.1.4 伊文斯蓝。 2.1.5 甘油。 注：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液、0.01%~0.02%伊文斯蓝液和90%甘油缓冲盐水的配制见附录A。 注：所有化学试剂为分析纯。 2.2 仪器设备 2.2.1 单通道可调移液器及加样头。 2.2.2 染色缸。 2.2.3 保湿盒。 2.2.4 盖片。 2.2.5 恒温箱。 2.2.6 冰箱。 2.2.7 酸度计。 2.2.8 荧光显微镜。 2.3 标准试剂 2.3.1 多孔流行性出血热病毒抗原（-20℃保存）。 2.3.2 流行性出血热阳性血清。 2.3.3 流行性出血热阴性血清。 2.3.4 异硫氰酸荧光黄（FITC）标记的抗大鼠IgG荧光抗体。 3 采样 被检大鼠尾静脉采血0.5mL~1.0mL，待血液凝固后，以2300r/min离心15min，分离血清。血清置-20℃保存备用。 4 操作方法 4.1 准备抗原片 从低温冰箱中取出流行性出血热病毒细胞抗原片，冷风吹干。 4.2 稀释血清 将被检、阳性及阴性血清1:20稀释，分别取0.1mL加入0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液1.9mL，混匀。 4.3 加样 抗原片编号后，取1:20稀释的被检血清10μL，加入病毒抗原片孔内。每张抗原片均设阴性血清、阳性血清对照及标本自发荧光对照。阴性血清、阳性血清也与被检血清同样取10μL加入病毒抗原片孔内。标本自发荧光对照在对照孔内加入0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液10μL。 4.4 反应 抗原片置保湿盒内，37℃恒温培育30min。 4.5 洗玻片 取出抗原片，用0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（中间更换一次）洗涤三次，每次5min，最后用蒸馏水漂洗一次，冷风吹干。 4.6 稀释荧光抗体 用0.01%~0.02%伊文斯蓝液稀释FITC标记的抗大鼠IgG荧光抗体至工作浓度。 4.7 加荧光抗体 抗原片中每孔加入10μL工作浓度的荧光抗体。 4.8 反应 按4.4操作。 4.9 洗玻片 按4.5操作。 4.10 观察结果 在抗原片上滴加90%甘油缓冲盐水，对片置荧光显微镜下观察结果。 5 结果判定 5.1 判定方法 在荧光显微镜下观察，正常组织细胞被染成红色，细胞内病毒特异性免疫荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。出血热病毒的特异性荧光一般是散在的细小颗粒，但亦可为粗颗粒、团块，甚至片状荧光。 5.2 对照 5.2.1 自发荧光对照：无荧光，细胞被染成红色。 5.2.2 阴性血清对照：无荧光，细胞被染成红色。 5.2.3 阳性血清对照：细胞内病毒特异性免疫荧光闪烁，呈点状或片状。 5.3 检测样本判定 当各对照系成立方可进行判定。被检样本细胞浆内无荧光，细胞被染成红色，判为阴性反应；被检样本细胞浆内出现明显黄绿色荧光颗粒，判为阳性反应。 附录A （规范性附录） 试剂配制 A.1 1/15mol/L磷酸氢二钠的配制 称Na2HPO4·12H2O 23.876g，加蒸馏水溶解后定容至1000mL。 A.2 1/15mol/L磷酸二氢钾的配制 称KH2PO4 9.014g，加蒸馏水溶解后定容至1000mL。 A.3 生理盐水的配制 称8.5g NaCl，加蒸馏水溶解后，定容至1000mL。 A.4 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液的配制 1/15mol/L磷酸氢二钠 81mL 1/15mol/L磷酸二氢钾 19mL 生理盐水 566mL 用酸度计测定pH，并用1/15mol/L磷酸盐液校正至pH7.4。 A.5 0.01mol/L pH7.2磷酸缓冲液的配制 1/15mol/L磷酸氢二钠 7mL 1/15mol/L磷酸二氢钾 27mL 生理盐水 566mL 用酸度计测定pH，并用1/15mol/L磷酸盐液校正至pH7.2，121℃高压灭菌15min备用。 A.6 0.01%~0.02%伊文斯蓝液的配制 称0.1g~0.2g伊文斯蓝溶解于1000mL 0.01mol/L pH7.2 PBS中，室温保存。使用时再用同样PBS作10倍稀释。 A.7 90%甘油缓冲盐水的配制 取90mL甘油充分加入3.91mol/L pH7.2磷酸缓冲液一份，混匀。