SN/T 3577-2013转基因成分检测　棉花PCR-DHPLC检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 3577—2013

转基因成分检测
棉花 PCR-DHPLC 检测方法

Detection of genetically modified components—

Method for cotton using PCR-DHPLC

中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局 发 布

前 言

本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、国家纳米科学中心。

本标准主要起草人：章桂明、朱水芳、向才玉、程颖慧、凌杏园、汪朝晖、朱劲松、黄新、欧阳辉、王颖、仲建忠。

转基因成分检测
棉花 PCR-DHPLC 检测方法

1 范围

本标准规定了进出境棉花中转基因成分和品系的 PCR-DHPLC 检测方法。

本标准中检测方法适用于转基因棉花品系 MON531、MON1445、MON1698、MON15985 中的转基因成分和品系的检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法

SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

3 原理

变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，在 $50\ ^{\circ}\mathrm{C}$条件下分析样品，碱基对的数量决定样品峰的洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据相对分子质量从小到大的顺序被洗脱出来。本标准采用多重 PCR 方法针对转基因棉花含有的转基因成分同时进行扩增，扩增产物用 DHPLC进行分析。通过 DHPLC得到的洗脱峰与 marker比较确定相对分子质量大小，判定是否带有外源基因成分及确定转基因棉花品系。

4 设备、用具及试剂

4.1 设备及用具

组织粉碎机、PCR仪、DHPLC仪、水浴锅、电子天平(精度: $1/1\,000$以上)、普通离心机、低温冷冻高速离心机、冰箱、低温水箱、制冰机、恒温干燥箱、pH 计、移液器($0.1\ \mu\mathrm{L}, 0.5\ \mu\mathrm{L}, 2\ \mu\mathrm{L}, 10\ \mu\mathrm{L}, 20\ \mu\mathrm{L}$, $100\ \mu\mathrm{L}, 200\ \mu\mathrm{L}, 1\,000\ \mu\mathrm{L}$)、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、PCR管($0.2\ \mathrm{mL}$)、离心管($1.5\ \mathrm{mL}$, $2.0\ \mathrm{mL}$)、Tip 头($0.1\ \mu\mathrm{L} \sim 10\ \mu\mathrm{L}, 5\ \mu\mathrm{L} \sim 200\ \mu\mathrm{L}, 100\ \mu\mathrm{L} \sim 500\ \mu\mathrm{L}$)。

4.2 试剂

CTAB 提取液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、$70\%$乙醇、RNA酶($10\ \mathrm{mg/mL}$)、多重 PCR反应液缓冲液(Multiplex PCR Mix)、Taq DNA聚合酶、DHPLC缓冲液A:TEAA(0.1 mol/L, pH 7.0)、乙腈($0.025\%$), DHPLC 缓冲液 B: TEAA(0.1 mol/L, pH 7.0)、乙腈($25\%$), DHPLC 缓冲液 D:乙腈($75\%, \mathrm{pH}\, 7.0$)、分子量标记(marker)。