SN/T 1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T 1135.5—2007

马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

Identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

前 言

SN/T 1135共分为五个部分：

• ——马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；
• ——马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；
• ——马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；
• ——马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；
• ——马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。

本部分是SN/T 1135的第5部分。

本部分的附录B、附录C均为规范性附录，附录A为资料性附录。

本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。

本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。

本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

1 范围

SN/T 1135的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。

本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于SN/T 1135的本部分。

2.1
双抗体夹心酶联免疫吸附测定

在固相支持物上(酶联板)包被细菌特异性抗体,加入待测样品后,再用酶标记的细菌抗体进行免疫识别,最后通过酶促化学反应检测细菌是否存在的一种血清学检测方法。

2.2
PCR

以耐热DNA聚合酶和一对引物(与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段)通过高温(DNA分子变性)和低温(引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸)交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。

3 原理

马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus)属厚壁菌门(Firmicutes)厚壁细菌纲(Firmibacteria)棒形杆菌属(Clavibacter),依靠病薯进行远距离传播。寄主及世界分布参见附录A。

4 仪器和用具

4.1 仪器设备

PCR仪,超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪,高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统,酶标仪。

4.2 主要试剂

除另有规定外,所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、氯化镁(MgCl₂)、dNTPs(dATP,dTTP, dCTP,dGTP)、TaqDNA聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、硫酸镁(MgSO₄)、葡萄糖、琼脂,酶联检测试剂见附录B。

5 病菌的鉴定

5.1 症状检查

取样量1%~5%(若样品少可适量增大比例)的块茎进行检查。将块茎横切,检查环腐病菌侵染症状,挤压块茎,检查维管组织是否浸润。发病轻者维管束变黄,呈不连续的点状变色;重者整个维管束环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织,呈环状腐烂,严重时可引起皮层与髓部组织分离,轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显,随病害发展,皮色变暗或变褐,严重时表皮可出现裂纹。

5.2 双抗体夹心酶联免疫吸附测定

利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛(见附录B),若检测结果为阳性,需进行病原