NY/T 544-2002猪流行性腹泻诊断技术

ICS 11.220 NY

B 41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 544—2002

猪流行性腹泻诊断技术

Diagnostic techniques for porcine epidemic diarrhoea

2002-08-27 发布 2002-12-01 实施

中华人民共和国农业部 发 布

前 言

猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。

本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出。

本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。

本标准主要起草人：马思奇、王明、宣华、冯力、佟有恩。

猪流行性腹泻诊断技术

1 范围

本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),检测抗体的血清中和试验、间接 ELISA 试验技术。

本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。

2 病毒分离与鉴定

2.1 材料准备

2.1.1 器材

倒置显微镜,冷冻离心机,微孔滤器,细胞培养瓶,盖玻片,温箱等。

2.1.2 培养基及溶液的配制

磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录 A)。

2.1.3 细胞

Vero 细胞系。

2.2 病毒分离

2.2.1 病料采集

采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒,样品冷冻保存。

2.2.2 病料处理

将采集的小段空肠连同肠内容物用含 $1\,000 \text{ IU/mL}$ 青霉素、$1\,000 \text{ }\mu\text{g/mL}$ 链霉素、PBS液制成5倍悬液,在4℃条件下 $3\,000 \text{ r/min}$ 离心 $30 \text{ min}$,取上清液,经 $0.22 \text{ }\mu\text{m}$ 微孔滤膜过滤,分装,$-20^\circ\text{C}$保存备用。

2.2.3 接种及观察

将过滤液(病毒培养液的10%)接种于 Vero 细胞单层上,同时加过滤液量50%的病毒培养液,$37^\circ\text{C}$吸附 $1 \text{ h}$,根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量,置 $37^\circ\text{C}$培养,逐日观察 $3 \text{ d} \sim 4 \text{ d}$,按致细胞病变作用(CPE)变化情况,可盲传2代~3代。

2.3 结果判定

CPE变化的特点是:细胞面粗糙,颗粒增多,有多核细胞(7个~8个甚至几十个),并可见空斑样小区,细胞逐渐脱落,这是特征性的CPE,可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片,收获后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察,用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。

3 直接荧光抗体法

3.1 材料准备

3.1.1 器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。

3.1.2 荧光抗体(FA)。

3.1.3 溶液配制:磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B)。