本标准规定了用微生物法和反相高压液相色谱法测定烟酸和烟酰胺的方法。本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中烟酸和烟酰胺的测定；方法二适用于婴儿配方乳粉中烟酸和烟酰胺的测定。 GB/T 5413.15-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 烟酸和烟酰胺的测定 GB/T5413.15-1997 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T5413.15--1997
本标准给出两种方法，方法一是微生物法，为等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC)方法，虽然操作步骤繁杂，但测定结果准确度高。方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一一种快速、准确的方法。
本标准方法一为仲裁法。
本系列标准从实施之日起，代替GB5413一85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人：杨金宝、鄂来明、王芸、刘波。281
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
烟酸和烟胺的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children-Determination of vitamin PP content1范围
GB/T 5413.15—1997
代替GB5413—85
本标准规定了用微生物法和反相高压液相色谱法测定烟酸和烟酰胺的方法。本标准方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中烟酸和烟酰胺的测定，方法二适用于婴儿配方乳粉中烟酸和烟酰胺的测定。
方法微生物法
2方法提要
通过对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）生长的酸度测定来评价烟酸和烟酰胺的含量。试剂、菌种和培养基
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 硫酸溶液，c(H,SO,)为 10mol/L。将质量分数为95%～98%的280mL浓硫酸缓慢加入到600mL水中，边加边搅拌，冷却，定容到1000mL。
3.2硫酸溶液，c(H,SO,)为 1mol/L。将100mL10mol/L的硫酸溶液（3.1)用水稀释至1000mL。3.3氢氧化钠溶液，c(NaOH)为150g/L。将150g氢氧化钠溶解在盛有400mL水的烧杯中，该烧杯放入冷水浴中，冷却后，再用水稀释至1000mL，搅拌，转移到试剂瓶中。3.4盐酸溶液，c(HCI)为0. 1mol/L。吸取10mol/L的盐酸溶液10mL，用水稀释至1000mL。3.5氢氧化钠溶液，c(NaOH)为0.1mol/L。用水稀释1mol/L的氢氧化钠溶液100mL至1L，用邻苯二甲酸氢钾标定。3.6乙醇溶液，体积分数为25%。将体积分数为95%的乙醇溶液250mL，用水稀释至950mL。3.7菌种：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)。3.8培养基
3.8.1乳酸杆菌琼脂培养基：光解陈15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2（25℃）。国家技术监督局1997-05-28批准282
1998-09-01实施
GB/T 5413.15---1997
3.8.2乳酸杆菌肉汤培养基：光解陈15g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8士0.2（25℃）。3.8.3烟酸测定用培养基：维生素测定用CasaminoAcids12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，β-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氟化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。加蒸馏水至1000mL，pH6.7土0.2（25℃）。4仪器
常用实验室仪器及：
pH计。
5制备
5.1接种的制备
从植物乳杆菌（Lactobacillus planlarum)贮备菌种中移取部分菌体到灭菌的10mL液体培养基中。选择30℃（±0.5℃）～35℃（±0.5℃）之间恒温培养18～24h。5.2标准溶液的制备
5.2.1烟酸标准贮备液，浓度为100μg/mL。从五氧化二磷干燥器中取出标样，精确称取50~~60mg尼克酸，溶解在乙醇溶液（3.6）中，继续加乙醇溶液，使尼克酸的准确含量为100μg/mL，放入冰箱。5.2.2烟酸标准中间溶液，浓度为10μg/ml。从标准贮备液（5.2.1)中吸100mL，加体积分数为25%乙醇溶液至1L，贮于冰箱中。5.2.3标准工作溶液，烟酸的浓度100mg/mL。从标准中间液（5.2.2)中吸5.0mL，用水稀释至500.0mL。每次使用前重新制备该标准溶液。6操作步骤
6.1测定溶液的制备
精确称取一定量样品，约含烟酸0.1mg。转入250mL烧杯中，加10倍于干粉质量的2mol/L的硫酸溶液。bzxz.net
充分混合样品，用1mol/L的硫酸溶液（3.2）洗下瓶口边上的样品，121℃灭菌30min，冷却。要充分搅拌，直到颗粒分散。
充分搅拌，用氢氧化钠溶液（3.3)调pH值6.0～6.5，迅速加入盐酸溶液（3.4)，直到不再有蛋白产生（pH4.5是许多蛋白质的等电点），用水稀释混合物到100mL，过滤。如果很难过滤，离心或通过过滤板过滤。吸25mL上清液到100mL烧瓶中，充分搅拌，调pH6.8（用3.5），移入到250ml.带有刻度的容量瓶中，用水稀释到刻度，如产生絮状，再过滤。6.2标准曲线的制备
按表1顺序加入蒸馏水，标准溶液和培养基于试管中，一式三份。表1
试管号No.
蒸馏水，mL
标准溶液，mL
培养基,mL
6.3样品
GB/T5413.15—1997
按表2顺序加入蒸馏水、样品和培养基于试管中，一一式三份。表2
试管号 No.
蒸馏水，mL
样品，mL
培养基,mL
6.4灭菌
直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀（灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响）。121℃灭菌10min。6.5接种
无菌地接种每个管，均加入一滴适当的接种物。除标准曲线中试管No.1以外。盖上盖，充分振荡所有管。
在28～40℃之间选择一个恒定温度（士0.5℃），培养60～72h。6.7测定（酸度法）
试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品溶液中无其他菌生长。用溴香草酚蓝作指示剂，用氢氧化钠溶液（3.5)滴定每个管中溶液，或以pH6.8为电位滴定终点。如果接种空白滴定反应等于或高于未接种空白水平的1.5mL，则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.0mL的反应等于c(NaOH)=0.1mol/L的氢氧化钠溶液8~～~12mL的滴定度。7 分析结果的表述
样品中烟酸含量（mg/100g或100mL）=式中：X——从曲线中查得的样品中烟酸的平均含量，ug,F稀释因子，
8允许差
样品的质量或体积，g或mL。
同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二反相高压液相色谱法
9方法提要
样品经热水萃取、酸性沉淀蛋白质后，以反相C1:色谱柱分离，用紫外检测器定量。10试剂
10. 1 盐酸溶液:c(HCI)为 5. 0mol /L。10.2氢氧化钠溶液：c(NaOH)为 5.0mol/L。10.3高氟酸：体积分数为60%。
10.4无水甲醇：色谱纯。
10.5异丙醇：色谱纯。
10.6辛烷磺酸钠：优级纯。
10.7标准溶液
GB/T5413.151997
10.7.1烟酸及烟酰胺标准中间溶液，浓度为100μg/mL。称取烟酸及烟酰胺标准品各10.0mg，用水溶解，然后分别定容至100mL容量瓶中。10.7.2烟酸及烟酰胺混合标准工作溶液，浓度为5μg/mL。各取5.0mL上述标准中间溶液于100mL容量瓶中，用水定容（烟酸、烟酰胺浓度均为5μg/mL）。11仪器
常用实验室仪器及：
11.1高效液相色谱仪：带紫外检测器。11.2色谱柱：15cm×4.6mm，或同等性能的反相Ct柱。11.3酸度计。
11.4超声波振荡器。
12操作步骤
12.1样品预处理
12.1.1称样：精确称取样品5.000g，放人100mL锥形瓶中。12.1.2提取：在上述锥形瓶中，加入约60℃的蒸馏水25mL，摇勾后，置于超声波振荡器中振摇10min。
12.1.3沉淀：待样品溶液降至室温后，用盐酸溶液（10.1)调节样品溶液的pH值至1.70,放置2min后，再用氢氧化钠溶液（10.2)调节样品溶液的pH值至4.50。12.1.4定容：将样品溶液转至50mL容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于50mL容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗中自然过滤。取此滤液约10mL，经0.45μm微孔滤膜加压过滤，用10mL试管收集此滤液，即样品备用液。12.2仪器工作条件
检测器灵敏度：0.002AU/mV。
检测器波长：261nm。
柱温：25℃。
流速：1.00mL/min。
流动相：体积分数为7.0%的甲醇、体积分数为2.0%的异丙醇、1g/L辛烷磺酸钠的水溶液，用高氯酸调 pH=2. 10。
12.3定量分析
12.3.1上机样液的配制：准确吸取样品备用液1.00mL及1.00mL蒸馏水，合并于试管A中，此为A液；另准确吸取1.00mL样品备用液及1.00mL标准工作液，合并于试管B中，此为B液。12.3.2上机测定：注射一定量的A液进入液相色谱仪，得到峰面积A：；注射与A液相同体积的B液进入色谱仪，得到峰面积B：。
13分析结巢的表述
样品中维生素PP的含量（mg/100g）=X，+X，式中：X,—-样品中烟酸的含量，mg/100g；Xz样品中烟酰胺的含量，mg/100g。其中 X或 X2：
式中：m-
一样品的质量，g：
GB/T5413.15—1997
X1±2(mg/100g）=
一由12.3.2所得的A液的蜂面积；B,
由12.3.2所得的B液的峰面积；
A, X c. × V × 100
m(B - A,) × 1000
-标准工作液中烟酸或烟酰胺的浓度，μg/mL；样品溶液的体积，mL。
14允许差
同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。286
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