DB32/T4368—2022
饲料中玉米赤霉烯酮的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法

**前言**
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位为江苏省家禽科学研究所、上海雄图生物科技有限公司。本文件主要起草人：施寿荣、汪劲能、张鹏飞、肖蕴祺、胡艳、邵丹、沈一茹、张珊、王强。

**目次**
1 范围
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 原理
5 试剂和材料
6 仪器和设备
7 样品制备
8 样品前处理
9 标准曲线制定
10 检测过程
11 结果计算
12 方法性能

**1 范围**
本文件规定了饲料中玉米赤霉烯酮测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、样品前处理、标准曲线制定、检测过程、结果计算和方法性能。本文件适用于饲料原料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料等试样中玉米赤霉烯酮的测定。

**2 规范性引用文件**
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备

**3 术语和定义**
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 时间分辨荧光微球 (time resolved fluorescent microsphere)：形状为球形，直径在几纳米至几十微米之间，微球表面或内部负载有荧光物质，在受到一定的能量激发时能够发出荧光的微粒，其荧光半衰期比普通荧光长。微球表面修饰有合适密度的羧基或其他功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联；微球所包埋的镧系稀土元素经过了整合，无需解离增强步骤。
3.2 时间分辨荧光免疫层析定量法 (time resolved fluorescence immunochromatography quantitative method)：用时间分辨荧光微球标记抗原或抗体制作层析试纸条，利用时间分辨荧光微球的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨的方法，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

**4 原理**
试样中玉米赤霉烯酮与时间分辨荧光微球标记的特异性抗体结合后，抑制了层析过程中标记抗体与试纸条T线玉米赤霉烯酮抗原的免疫反应，使T线时间分辨荧光强度降低；质控线C线结合的荧光标记物浓度与样品中玉米赤霉烯酮的浓度无关。层析结束后，通过仪器检测计算试纸条T线和C线的时间分辨荧光强度比值，并与设定的标准曲线进行比对，从而进行准确定量分析。

**5 试剂和材料**
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
5.1 十二水磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄·12H₂O)
5.2 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)
5.3 氯化钾 (KCl)
5.4 氯化钠 (NaCl)
5.5 盐酸 (HCl)
5.6 甲醇 (CH₃OH)
5.7 蔗糖 (C₁₂H₂₂O₁₁)
5.8 吐温-20 (Tween-20)
5.9 磷酸盐缓冲溶液：取2.178 g磷酸氢二钠（5.1）、0.144 g磷酸二氢钾（5.2）、0.12 g氯化钾（5.3）、4.8 g氯化钠（5.4），溶解于1 L水中，用适量盐酸（5.5）调pH至6.8~7.2。
5.10 提取液：取800 mL甲醇（5.6）用纯水定容至1 L，用于样品提取。
5.11 稀释液：在1 L磷酸盐缓冲溶液（5.9）中分别加入1.0 g蔗糖（5.7）、2.0 g吐温-20（5.8），混匀，用于样品上清的稀释。
5.12 玉米赤霉烯酮标准溶液：浓度50 mg/L。
5.13 玉米赤霉烯酮标准储备液：取玉米赤霉烯酮标准溶液（5.12）1 mL于2 mL容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀，制备成浓度为25 mg/L的储备液。
5.14 ID卡：用于存储标准曲线和项目信息，直接插入荧光免疫定量分析仪使用。
5.15 玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析定量试纸条：灵敏度不低于20 μg/kg。试纸条结构示意图包含：加样孔、样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫、底板、T线、C线。
说明：结合垫包被荧光微球标记的玉米赤霉烯酮抗体，T线包被玉米赤霉烯酮封闭抗原，C线包被二抗。