DB15/T2022—2020
牛和马源性成分同步检测方法
实时荧光PCR法

**前言**
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出。
本文件由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会（SAM/TC39）归口。
本文件起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心。
本文件主要起草人：郭梁、罗建兴、徐伟良、其勒木格、郭元晟、李春冬、刘国强。

**1 范围**
本文件描述了动物产品（肉、乳）中牛和马源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中牛和马源性成分的定性检测。

**2 规范性引用文件**
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范
食品分子生物学检测术语和定义

**3 术语和定义**
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 实时荧光PCR (real-time PCR)
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。
3.2 Ct值 (cycle threshold)
每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数。
3.3 阳性对照 (positive control)
用已知含有牛和马源性成分的样品作阳性对照。
3.4 阴性对照 (negative control)
用已知不含有牛和马源性成分的样品作阴性对照。
3.5 空白对照 (blank control)
用等体积的灭菌水代替模板DNA作空白对照。

**4 原理**
利用不同荧光基团标记特异性牛和马探针以及质控探针，采用多重实时荧光PCR技术，对提取于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA进行扩增。在同一反应中对牛和马特异基因以及质控基因同时扩增，三种荧光同时检测。其中，同管质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，避免假阴性结果。通过评价Ct值判断动物产品（肉、乳）是否含有牛和马源性成分。

**5 试剂和材料**
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 三氯甲烷
5.2 异戊醇
5.3 异丙醇
5.4 95%乙醇
5.5 75%乙醇
5.6 CTAB提取液：称取10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、40.6g NaCl、6.06g Tris base（三羟甲基氨基甲烷）、3.94g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），加入800mL水，在65℃水浴加热溶解，用HCl调节pH至8.0，加水定容至1000mL，在121℃条件下灭菌30min。使用前加入终浓度为2%的$eta$-巯基乙醇。
5.7 乳化剂：量取100mL Triton X-100（聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，90%）、125mL乙醇（95%）、855mL NaCl溶液（0.9g/L），加水定容至1000mL，在121℃条件下灭菌30min。
5.8 PBS缓冲液（磷酸缓冲液）：称取 NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，加入800mL水溶解，用HCl调节pH至7.4，加水定容至1000mL，在121℃条件下灭菌30min。
5.9 实时荧光PCR反应混合液：1U~2U的Taq酶、1X CR冲洗液、2.5mmol/L~4.0mmol/L的MgCl2、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的dNTP。也可以使用同等效果的商品试剂盒。
5.10 牛和马源性成分扩增引物和探针详见表1。

**表1 引物和探针序列**
名称 | 正向引物 | 反向引物 | 特异性探针 | 目标基因/大小
牛特异性探针 | TTGAATYAGGCCATGAAGC | CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC | FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGGTAMRA | 线粒体12SrRNA基因 (牛120bp)
马特异性探针 | TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT | ACACACCGCCCGTCACCCT | HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT | 线粒体12SrRNA基因 (马121bp)
质控探针 | - | - | ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2 | -
注：用灭菌水分别将上述引物和探针稀释到10$mu$mol/L，探针需避光保存，序列中Y代表T/C。

**6 仪器和设备**
6.1 实时荧光PCR仪：通道数3，温度控制精度$pm$0.1℃。
6.2 核酸分析仪或紫外分光光度计。
6.3 离心机：离心力$ge$12000g。
6.4 微量移液器：0.5$mu$L~10$mu$L, 10$mu$L~100$mu$L, 20$mu$L~200$mu$L, 100$mu$L~1000$mu$L。
6.5 金属浴或恒温水浴锅：温度控制精度$pm$0.5℃。
6.6 pH计：0.01级。
6.7 均质器。
6.8 搅拌器。
6.9 分析天平：感量0.1g和0.0001g。
6.10 高压灭菌锅。
6.11 旋涡混匀器。

**7 分析步骤**
7.1 样品制备
利用均质器将固态样品充分混匀，装入清洁容器中，加盖后，注明标记。
利用搅拌器将液态样品充分混匀，装入清洁容器中，加盖后，注明标记，20℃保存。
7.2 DNA提取
7.2.1 鲜肉及肉乳制品样品（固态）：称取100mg均质固态样品于1.5mL灭菌离心管中；加入700$mu$L CTAB提取液（5.6），充分混匀置于65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀一次；13000rpm离心5min，转移上清液于新离心管中，加入等体积三氯甲烷和异戊醇混合液（体积比为24:1），旋涡混匀，13000rpm离心5min，取上清液于新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13000rpm离心5min，并弃上清液，75%乙醇洗涤两次（13000rpm离心30s弃去上清液），室温晾干，加入20$mu$L～50$mu$L灭菌水溶解，-20℃保存。对阳性对照和阴性对照进行同法操作。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同等效果的DNA提取试剂盒。