DB15/T2036—2020
奶牛细菌性乳房炎精准治疗药物筛选技术规程

内蒙古自治区地方标准
发布日期：2020-11-30
实施日期：2020-12-30

前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。
本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。
本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。
本文件主要起草人：王丽芳、姚一萍、史培、杨健、宋洁、张三粉、钟华晨、郭晨阳、连海飞、羿静、冯小慧、凤英、云伏雨。

1 范围
本文件规定了奶牛细菌性乳房炎精准应用抗生素的技术措施。本文件适用于奶牛养殖场采用精准治疗的药物筛选技术操作程序。

2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 乳房炎 (mastitis)：乳腺组织受到物理、化学、微生物刺激所发生的以乳腺组织发生病理变化，乳汁中的体细胞增多，乳的性状品质发生异常为特征的一种炎性变化。
3.2 最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration)：用试管稀释法测定细菌对药物的敏感性。完全抑制细菌生长的最高稀释管1毫升所含的药量，亦即被测细菌对该药的敏感度。因为物种和细菌的种类不同，需具体规定药物的稀释范围、使用培养基的种类、加菌量、培养条件和判定结果的时长。
3.3 耐药性 (drug resistance)
3.4 耐药率 (drug resistance rate)：耐药菌的数量占总菌数量的比例，常以百分率表示。
3.5 大肠杆菌 (Escherichia coli)：肠杆菌科、埃希氏菌属中的主要细菌。注：兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37℃，pH为7.2～7.4。
3.6 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)：葡萄球菌属，革兰氏阳性菌。注：最适生长温度为37℃，pH为7.0～7.5，耐高盐，在含10%-15%NaCl肉汤或营养琼脂培养基上能够生长。
3.7 无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)：一种革兰氏阳性链球菌，可以导致感染腺体，长期减少产乳量。注：该菌生长适宜温度为37℃，pH为7.4~7.6，在普通培养基中生长不良，在加有血液或血清的培养基中生长良好。
3.8 克雷伯氏菌 (Klebsiella)：克雷伯氏菌属，是一种无运动力、有荚膜的革兰氏阴性菌。注：兼性厌氧菌，对营养要求一般，最适生长温度为37℃。

4 试剂和材料
4.1 乳头药浴液
4.2 甘油 (C3H8O3)
4.3 75%酒精棉球
4.4 50mL离心管
4.5 5%绵羊血琼脂平板
4.6 9cm直径的培养皿
4.7 1uL和10uL两种规格的无菌接种环
4.8 16SrDNA引物
4.9 PCR试剂盒
4.10 DNA marker: DL 2000
4.11 MHB肉汤
4.12 比浊管
4.13 质控菌株 (ATCC 29213/25922)
4.14 96孔组合式药敏MIC&MBC测试盒（冻干型），产品信息详见说明书
4.15 灭菌吸头 (5mL/1mL/200uL/10uL)
4.16 灭菌离心管 (2mL)
4.17 无菌医用棉签

5 仪器和设备
5.1 电子天平 (感量为0.001g)
5.2 高压灭菌锅
5.3 生物安全柜
5.4 恒温培养箱
5.5 恒温振荡培养箱
5.6 高速离心机 (转速12000r/min)
5.7 PCR仪
5.8 微波炉
5.9 DNA电泳设备
5.10 凝胶成像系统
5.11 麦氏比浊仪
5.12 移液器 (包括300uL、5mL/1mL/200uL/10uL/2.5uL单通道)
5.13 -20℃冰箱
5.14 -80℃冰箱

6 分析步骤
6.1 样品采集
采样前进行CMT（或LMT）检测，确定其是否为乳房炎患牛。采集乳房炎阳性样本，采时弃去前三把奶，无菌取乳样50mL左右，4℃保存待检。
6.2 细菌的分离、纯化和保存
6.2.1 分离